人类基因治療四大细胞系锻炼的工艺：浮悬、贴壁、微质粒载体在病毒样本生產中的采用

随着基因编辑技术和基因递送载体等技术的逐步提高与完善，在肿瘤治疗、罕见病等基因治疗主战场的巨大市场前提下，越来越多本土和跨国制药企业布局基因和细胞治疗行业。截至2020年9月，ClinicalTrails.gov官网显示全球已有超过4310项基因治疗进入临床试验，随着项目的临床推进，病毒的大规模生产已成为基因治疗产业化的主要限制因素。
 

在基因治疗项目中，AAV等病毒通过转染相应的宿主细胞进行生产。目前的生产方式主要有贴壁培养，微载体培养以及悬浮培养。由于贴壁细胞与悬浮细胞在培养方式有着本质不同，如细胞的形态、代谢、生长行为等，目的产物的质量与产量会受到极大影响。因此，选择合适的细胞培养工艺，对于大规模病毒载体生产具有越来越重要的意义。本文主要介绍了贴壁、微载体、悬浮三种工艺在病毒生产中的应用。

 

贴壁教育培养
 

贴壁培养以细胞工厂为例，细胞工厂相较于传统的细胞瓶，可节省更多人力、物力、时间、空间，方便按比例扩增；节省空间，受污染风险低，批间差异小；减低劳动强度和密集度，快速替代传统的转瓶培养技术，实现大规模的细胞培养。
 

工艺开发案例

以痘病毒为例，通过工艺不断深入优化，病毒滴度提高10倍，单细胞产量达260 PFU/cell，在提高产量的同时又降低了生产成本，并验证了优化后的病毒生产工艺适用于大规模生产。

 

微载体培养
 

微载体培养结合了贴壁培养和悬浮培养各自的优点，提供了极大的培养表面积/体积比，提供了高的细胞产量而无需凭借大容量的设备，使得细胞在贴壁状态实现了悬浮培养。对于贴壁依赖性细胞培养而言，微载体培养需要相当少的空间，就可生产一定量的细胞或细胞产物，不仅减少了劳动力需求，又降低了污染风险。

工艺开发实例

以AAV为例，HEK293T在贴壁和微载体培养工艺下的产毒水平

在1L反应器中进行微载体培养工艺确认，各参数如下表所示,AAV的滴度曲线如下图所示，随培养时间延长，上清和细胞沉淀的滴度均不断上升，但细胞滴度更为明显，120h可达4.5 E+11v.g/ml，约上清的3-4倍，且滴度较Spinner更高。该结果说明了Spinner中的微载体工艺可以在1L反应器中实现，同时验证了AAV的微载体的病毒生产工艺适用于大规模生产。

  

悬浮按钮塑造
 

悬浮培养容易实现全过程密闭操作，过程无菌控制简单；取样简便、培养操作简单可控；便于放大、污染率和成本低；容易更换培养液，采用灌流培养的方式使细胞达到高密度生长；可实现无血清培养，减少由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；对工业化生产来说，在悬浮培养模式下，通过大体积生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式。
 

工艺开发案例

以重组腺病毒为例，采用无血清悬浮293细胞培养，经过多个关键因素的优化，滴度从最初的1.00 E+9 PFU/mL 提高至5.20 E+9 PFU/mL，产量提高约5倍，有效实现大规模无血清悬浮培养腺病毒载体。

 

无血清悬浮293培养腺病毒 

 

 

汇总
 

同一种细胞在悬浮培养和贴罐培养时对同一病毒的敏感性不同；同一株细胞不同的克隆对营养条件有不同的需求，对病毒敏感性亦可能不同。 常根据毒株特性，综合考虑所用毒株能在何种细胞上增殖、表达，悬浮或贴壁细胞属性足否适合大规模培养，规模和技术是否影响表达的稳定性等因素选择合适的宿主细胞及合适的培养工艺。
 

通过不断的工艺摸索，银河集团官网 成功建立贴壁、悬浮和微载体培养工艺平台，可适用于不同类型病毒载体的生产，且通过工艺优化均能满足大规模生产的要求。

 

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