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单血细胞转录组测序简绍

单组织血受损人体生殖上皮内部转录组测序（Single cell RNA sequencing），简约并不是，可以说是在1个组织血受损人体生殖上皮内部平行上，对转录组平行实现测序进行分析的新工艺。过去文化测序方式常常在多组织血受损人体生殖上皮内部根本上实现，到的是堆组织血受损人体生殖上皮内部中无线信号的对数正态分布，失去了了组织血受损人体生殖上皮内部异质性（组织血受损人体生殖上皮内部彼此的文化差异）的讯息。而单组织血受损人体生殖上皮内部测序新工艺才可以论述1个组织血受损人体生殖上皮内部的dna展现状态下，改善了过去文化测序没办法改善的组织血受损人体生殖上皮内部异质性问題。

这一项方法自2010年第三次上市之初，将持续不停地壮大。近几年以来来，单血人体神经细胞测序经历英文了溃败式的壮大和科普。它在良性肿瘤、生长怪物体学、微怪物体学、神经系统专业等方向表现注重点功能，当上性命专业科研的端点。单血人体神经细胞转录组测序方法的不停壮大将在招商精准进行诊治、怪物体临床研究医学科研和临床研究利用中表现越发越重点的功能。单血人体神经细胞测序方法未能统筹推进怪物体学方向前行壮大，为独特性化以防和进行诊治带来了了方法帮助。

肿瘤研究：单神经元测序技巧帮助到阐释肉瘤内区别神经元的类型的异质性，探究肉瘤微室内环境中神经元的转录组表达方式和免疫细胞职能。
发育生物学：完成单生殖内部测序，我国都可以定位跟踪胚胎大成熟具体步骤中多种生殖内部的基因组表述转化，掌握生殖内部两极分化和大成熟。
神经科学：探讨单独一个运动周围中枢感觉神经元的转录组可以协助我们都能够理解运动周围中枢感觉神经设备的职能、运动周围中枢感觉神经退行性疾患还有运动周围中枢感觉神经元相互之间间的相互之间的功效。
免疫学：单组织肿瘤上皮组织細胞测序新技术能够调查天然免疫组织肿瘤上皮组织細胞的异质性，举例子T组织肿瘤上皮组织細胞、B组织肿瘤上皮组织細胞和巨噬组织肿瘤上皮组织細胞的功能性的情况。
微生物学：按照单内部测序，我们大家可不可以坚持问题导向知道微怪物群落中各个大肠杆菌、病毒有哪些和另外的微怪物的人类基因展示。

10x 3’单内部

利用10x Genomics Chromium微流控整体化，保证采用队列商品标贴有什么区别吗各种受损肿瘤受损細胞和转录本。微流控整体化工作区的直径极小单次采用一位受损肿瘤受损細胞。前提在工作区中放入含有商品标贴的凝露微珠，独立受损肿瘤受损細胞和独立含有商品标贴的凝露微珠整合，前者被加如的油背包到一位液滴中，进行油包水管理体制。凝露微珠上含有很多蕴含凝露微珠特情人Barcode队列、原子核特情人UMI队列和polyT队列的引物队列，将受损肿瘤受损細胞裂解后mRNA原子核被引物队列中的polyT猎取，测序后进行携含有Barcode和UMI队列的cDNA，就行保证将各种受损肿瘤受损細胞源头的各种mRNA原子核换成商品标贴。

Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，每个微珠表面携带有几十万个Oligo序列（如下图）。Oligo dT序列由4个部分组成：read1用于上机测序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带不同的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序列进行绝对定量，避免扩增产生偏好；第四段是30bp的ployT，用于捕获有ployA尾的转录本。

对制得好的单癌细胞膜悬液先进的行质监，质监符合标准后与Gel Beads和油分別进入到Chromium Chip G的各不相同工作区，途经微水射流“T字”相交机系统成型GEM。立刻癌细胞膜裂解，Gel Beads半自动溶解度降低很多引物回文序列，与中有PolyA的mRNA实现逆袭录，合成中有10x Barcode和UMI讯息的cDNA第一个链。

样本起始量与送样建议

组织类型	新鲜组织、新鲜悬液或速冻组织
组织深浅	＜40 μm
癌细胞生物	>85%（不应除去组织团/宝箱/杂物等）
组织细胞浓硫酸浓度	700~1200 cells/μL
神经细胞总产值	＞10万

小心事情：基本样品准备好要点，请联络高清在线客服咨询专员。

生物信息学分析内容

代表性文章

【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.

案例展示

Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性
论文标题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
发表杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，手术切除肿瘤样本P1
技术手段：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选

研究背景

肝细胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。由各种细胞表面标志物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，这在定义靶向疗法时构成了挑战。研究人员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和功能分析用以评估CSC的异质性程度。结果表明，CSC在单细胞水平上的表型、功能和转录均存在异质性性，不同的CSC亚群具有不同的分子特征。而且有趣的是，不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关，并且彼此相互独立，表明CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。

稿件的结果

大量数据表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面标志物可以定义CSC，研究人员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7不同细胞亚群，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。免疫荧光染色表明，在两种细胞培养形态下（单层培养、球体培养）,两个HCC细胞系均表现出明显的细胞异质性。

HuH1和HuH7内部系系系（最原始内部系系数区分是1343、1134）一般致力于和异星工厂致力于（推动内部系系混干）2周后，研究探讨人数行政规章以下几种的表面标制物（CD24、CD133、EpCAM）分选内部系系，HuH1和HuH7进标制物呈呈阳性的CSCs比列区分为15-20%、8-12%，而标制物弱呈阳性化反应CSCs比列仅仅0-5%（图一为A-B），致力于后不相同内部系系亚群的自自动更新性能相互影响一定（图一为C-D）；分选后的内部系系要经过5个月致力于后，和未分的得内部系系相对，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+内部系系就能扩充变成搭配CSCs，而自愈下的Triple-内部系系就能扩充成搭配CSCs，有机会是是因为部份内部系系没有真正意义上的图标弱呈阳性化反应内部系系，也可以图标弱呈阳性化反应内部系系经力了更换转化成图标呈呈阳性内部系系（图一为E）。

科研人数进行SMART-Seq行为讲解HuH1和HuH7弱阳标签癌神经内部同时分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-癌神经内部）癌神经内部表示出谱（1个癌神经内部测序、10癌神经内部相混测序、100癌神经内部相混测序）资料，并与信息冷库中人胚胎干癌神经内部（hESC）、鼠内皮癌神经内部（mEC）和鼠造血干癌神经内部（mHSC）表示出谱信息说了非常，会意味着多种癌神经内部类群体现了多种的遗传DNA表示出形式，且多种类型的癌神经内部中每位癌神经内部的遗传DNA表示出形式均具备文化的距离，HuH7癌神经内部间文化的距离不超HuH1；当癌神经内部相混（10癌神经内部相混、100癌神经内部相混）后这文化的距离能力清晰拉低（右图A）。而当随便聚类算法HuH7癌神经内部时，会意味着多种标签癌神经内部两方能区分开（右图B）。上文信息均意味着单癌神经内部程度上转录组具备异质性。

调查职工较为了HuH7弱阳标志符号神经组织（Triple+）和呈阴性标志符号神经组织（Triple-）DNA遗传表示之间的关系，司法鉴定到的286个Triple+相关的DNA遗传可不可以精准预测来于LCI序列的240例良性肉瘤样版、来于TCGA的250例良性肉瘤样版的整体上我的世界生存率，但在非良性肉瘤样版中有意无意义。

有差异标签CSC人体人体细胞系客群心理表观遗传体现比数据进行分析，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+表现表观遗传主要不相交（所示A），IPA环路数据进行分析也表述有差异人体人体细胞系客群心理的环路也没有相交（所示C-F），又很有差异人体人体细胞系客群心理表现表观遗传会采用经营期預測，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有优势可言（所示B）。

想要产品明白癌组织组织核核社会群体各种各样性，研发师主要包括10X 单癌组织组织核核测序途径，对384几个HuH1、HuH7、P1癌组织组织核核对其进行了剖析， HuH1应该划分成多个亚群，HuH7划分成4个癌组织组织核核亚群，P1划分成3个癌组织组织核核亚群，癌组织组织核核聚类分析法结论与与SMART-seq结论近似（该图A）。CSC标准物，举例EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （该图B）及及HCC特异表观遗传，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（该图C）在与众不同癌组织组织核核亚群中体现具有异质性。P1的3个癌组织组织核核亚群中体现了山里分子 (KLF4、POU5F1、MYC)，干癌组织组织核核marker (NANOG)，白癌组织组织核核marker(PTPRC), T癌组织组织核核 markers (CD3E, CD8A) 和B癌组织组织核核marker (CD79A) ，但其体现也具有异质性，但其中首要个和2个P1亚群为HCC侵润性白癌组织组织核核（分离体现T癌组织组织核核marker和B癌组织组织核核marker），第3个个P1亚微信群主为了HCC癌组织组织核核（该图D）。

参考文献

Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778

结果展示

1. 单生殖细胞亚群分类别

针对PCA结果中选取前10个主成分，采用graph-based聚类方法对细胞进行分类。使用相同的数据进行t-SNE分析，然后将聚类结果在t-SNE映射中展示。

2. Marker基因组数据分析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图

3. 区别dnaKEGG含有性探讨

Pathway通路图展示与说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差异表达转录本，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差异表达转录本，橘黄色代表注释到某个ko节点不仅有上调又有下调的显著差异表达转录本。方框内的4位数字表示各种酶的EC编号；空心圆圈表示小分子化合物；实心箭头表示生化反应的方向；虚线箭头连接其他的相关代谢途径。下图仅为报告中的展示图片

常见问题（FAQ）

1、单细胞转录组测序需要做重复吗？

单细胞测序的目的在于鉴定细胞群体中的不同亚群、得到新的重要分子标志物和鉴定稀有细胞亚群等，因此更多的是关注细胞和细胞之间的差别。从目前已有的文献看，对重复数没有强制要求。但从近期的发文趋势来看，建议每组设置样本数3~5 个，临床样本根据实际情况建议每组 5 例以上。

2、组织样本如何制备单细胞悬液？

单细胞转录组测序目前没有一个统一的样本制备方法，针对于不同的组织样本，有不同类型的样本单细胞制备方法。此外，可以具体根据老师提供的具体样本类型，查阅相关的文献，探讨适合于老师样本的单细胞悬液制备方法。

3、单细胞转录组每个细胞能捕获到多少个基因？

根据不同的细胞类型，捕获到的基因数会有区别，有些细胞类型高的会在3000左右，而有些大概在1000左右。基因检出数与样本状态有关，不同类型的样本，基因检出数可能存在数倍的差异。

SeekOneDD 3’单生殖细胞

SeekOneDD (Digital Droplet) 单神经组织3’转录组测序用到SeekOneMM单神经组织转录组采血管盒改变单神经组织转录成立库，用微孔过滤IC芯片(SeekOneChip)和核酸标签磁珠(Barcoded Beads)便可改变单神经组织的阻止、标签。终于搭建出兼容Illumina 测序仪的mtk量单神经组织转录组文库改变测序，己经改变一全系列生信进行分析。

SeekOneDD装置为微流控技术水平原理图，确认油包水变现单癌癌血组织细胞提取捕捉，在抑菌凝胶微珠上Barcoded Beads对有所不同癌癌血组织细胞开始图标，确认UMI的价格标签对mRNA开始一定量，来引入高通骁龙量单癌癌血组织细胞文库，动态数据文件下机后在使用SeekOne Tools顺利完成单癌癌血组织细胞动态数据文件质控处理。

BD 3’单上皮细胞

BD Rhapsody的高技巧应用不要再回收利用回收利用网络流控孔道投射去血组织和投射去的磁珠激发通过单血组织捉捕，而回收利用CytoSeq独居特的的蜂窝板高技巧应用。该高技巧应用用20W+的细孔过滤（宏不小于Input血组织占比），切实保障单孔中的单血组织捉捕。在血组织捉捕顺利完成后，通过血组织裂解，血组织尽情释排出的mRNA就可以被polydT的beads在细孔过滤中捉捕。

BD Rhapsody Beads
由以下3部分组成：
1. CL（细胞标签,cell label）：一个磁珠上的CL序列相同，不同磁珠上的CL序列不同，从而达到区分细胞的作用；
2. UMI（unique molecular identifier）：一个磁珠上的引物UMI各不相同，用于区分不同的mRNA分子，避免PCR偏好性；
3. ploy dT：与mRNA 3‘端poly A互补配对，以捕获polyA尾的mRNA；

BD Rhapsody是通过填满15万个直径为为50 μm纳米纤维板的纳米纤维板板和过飞机安检体人体生殖生殖上皮細胞tag标签（cell label）的直径为为35 μm永强磁铁beads猎取体人体生殖生殖上皮細胞。将制法好的单体人体生殖生殖上皮細胞悬液铺至纳米纤维板板上，体人体生殖生殖上皮細胞靠主观能动性重力作用沉降低纳米纤维板底下，沉提速度慢的死体人体生殖生殖上皮細胞和残渣在此十步会被清洗阴道掉；有效控制体人体生殖生殖上皮細胞数量，减低两体人体生殖生殖上皮細胞进入一名纳米纤维板的原因（生成doublets）；继续将beads铺至纳米纤维板板，同样的沉降低纳米纤维板板底下；清洗阴道掉多余的的beads并添加体人体生殖生殖上皮細胞裂解液，体人体生殖生殖上皮細胞挥发释释放的mRNA可能被polydT的beads在纳米纤维板中猎取。通过强磁铁二手回收beads到单管上实施后期的不可逆转录、建库等操作步骤。

10x 5’单组织细胞及免疫抗体组库

10x V(D)J 按照TCR/BCR节流过程区的连继巢式引物对总长cDNA展开增加，以提高个体户中其有T/B癌肿细胞的BCR和TCR的V(D)J总长队列合计。在癌肿微室内环境、皮肤感染性急病、组织冻胚移植后排座斥、免疫检测改善等研发行业有着具有广泛性的app。

科技主要优势

可实现成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序
精细到单细胞水平，能获得大量单细胞的免疫组库数据
大规模单细胞VDJ+表达谱测序，单个细胞成本大大降低

象征着性句子

ElhamAzizi, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell, 2018,DOI: //doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060

案例库呈现

单癌症细胞测序具体分析比较复杂的癌症微坏境

探究情况

了解肿瘤微环境中的免疫细胞表型，对了解癌症进展和免疫疗法的机制是必不可少的。本研究从8名乳腺癌患者的肿瘤样本及配对的正常血液、乳腺和淋巴结样本中获得多个免疫细胞，开展单细胞RNA测序实验。之后，利用SEQC流程和“Biscuit”算法，对这些组织中的免疫细胞进行聚类和鉴定。

研究思路

本研究总共鉴定出83个不同的免疫细胞簇，包括38个T细胞簇、27个骨髓谱系细胞簇、9个B细胞簇和9个自然杀伤细胞簇。大多数的细胞簇（除了其中的10个）是不止一名患者所共有的，尽管在肿瘤样本中的表型往往不同。研究指出，部分T细胞在肿瘤和正常组织中都存在，不过细胞毒性T细胞在肿瘤中更丰富，Treg细胞也是如此。
在一系列后续实验中，研究人员利用10X Genomics的方法获得27,000多个T细胞的TCR-seq和RNA-seq配对数据并开展分析。比较了正常组织和乳腺癌组织的免疫组库，发现表型扩增往往发生在乳腺癌微环境中。

这些观察结果，以及免疫细胞的RNA-seq和TCR-seq数据集和全面的分析平台，将有助于研究人员更好地了解免疫细胞促进和延缓肿瘤生长背后的分子机制。

参照资料

ElhamAzizi, et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell, 2018,DOI: //doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060

报告展示英文

1.V-J paired特征分析

V-J paired直接反应出CDR3或免疫组库的变化，图中横坐标为V Gene，纵坐标为J Gene。颜色越深表示V-J paired丰度越高。

2.V/J什么是基因特点分享

对CDR3 V/J基因序列长度分布情况进行统计，图中横坐标为CDR3(V Gene)碱基序列长度，纵坐标为对应的clonotype name频率，不同颜色表示不同V Gene，top10的V Gene用彩色表示，other（灰色部分）表示其他V Gene。

3.Clonotype分型

一个clonotype（克隆亚型）的定义为：一组唯一的CDR3核苷酸序列。Cell Ranger根据拼接得到的Consensus中的CDR3氨基酸序列进行Clonotype分型，其有效Barcode为该Clonotype的丰度。利用圈图展示免疫组库的top10 clonotype频率分布（clonality）。

10x 单生殖细胞ATAC-seq

ATAC-seq（Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，着色质易盛开领域中测序）是2014年由USAStanford大学时的William Greenleaf讲解新产品研发好几回种不一样的办法，凭借DNA转座酶融入mtk量测序技术工艺，来论述着色体的可入驻性。ATAC-seq的目的是，着色质易盛开领域中测序）凭借Tn5转座酶切开着色质的盛开领域中，并加进测序引物对其进行mtk量测序，完成动物短信浅析技术鉴定转录指数公式融入位点和核小体领域中座位，以此为论述什么是基因遗传调节作用、DNA 符印等出具能够的办法。完成论述相关动态下盛开着色质，会在DNA平均水平论述什么是基因遗传转录调节作用。

传统型的挖掘全表观遗传组组标准内休馆的刺绣质区域环境所采用的行为例如ATAC-seq、MNase-seq和DNase-seq，FAIRE-seq、chip-seq等。10x Genomics Chromium Single Cell ATAC Solution（10X scATAC-seq）是10 X Genomics新推新单体体细胞表观表观遗传组组学情况上揭露刺绣质可连近性的钻研措施。实现单体体细胞刺绣质可连近性图谱营造，除了能不清熟知刺绣质型式，还应该建模拿高甄别率转录指数公式政策调控网络上，为深入调查熟知消化道疾病的测试和诊治平整道路施工。

技木优点

可检测单细胞转录调控区域中的开放染色质
每个通道可容纳500-10000个细胞核
细胞核捕获率高达65%
运用10x官方软件和工具，可对单细胞基因调控网络进行精细化分析

代表英文性文章内容

Buenrostro J D , Corces M R , Lareau C A . Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.[J]. Cell, 2018.

装修经典案例会

联席各种单血细胞进行分析技术设备建模我们造血软件系统细胞分化的间隔调高谱

研究背景

造血分化是从造血干细胞分化为具有不同功能的细胞过程，在成人中主要发生在骨髓，最终产生淋巴系细胞（B,T,NK cell）,髓系-粒系（monocyte, granulocyte），红系（Ery,mega）等细胞类型，是研究干细胞分化、肿瘤免疫、血液疾病等的良好模型。造血分化过程是一个复杂、多阶段的，受多种因子调控的过程，单细胞表观基因组分析有助于解析造血干细胞转录和细胞命运异质性的顺式和反式调节机制。

研究思路

首先利用scATAC-seq数据从chromatin accessibility入手，分析造血分化过程染色质开放状态图谱的异质性；用ChromVAR R包预测TF的活动；采用多种聚类方法，如通过TF Z scores利用Hierarchical clustering 和t-SNE聚类，并采用了reference guided approach，基于bulk sample和算法对单细胞数据进行降维聚类分析；整合scRNA-seq 和scATAC-seq数据分析TF与chromatin accessibility，以及顺式调控元件和邻近基因的表达的相互关系。

研究结果

研究人员通过单细胞ATAC-Seq的研究策略，分析了10类已定义的人类造血系统分化细胞类型中染色质可接近性的数据，构建造血细胞分化中染色质可接近性状态的变化轨迹；并整合单细胞转录组数据，构建了转录因子动态调控轨迹。

从单人体癌内部RNA-seq和ATAC-seq的资源结合实际解析出示了对全人类造血事业的调整特征描述和各式各样的个人个人见解，在实验室或计算方法上资源结合实际各种各样单人体癌内部数据信息款式的进几步改变将为发肓或皮肤疾病人体癌内部运程决策分析出示单人体癌内部水准上的的视角。信心末来的事业结合实际单人体癌内部表观DNA组学、转录组学、核营养物质组学和谱系校正能否阐述对运行调整各种各样人体癌内部运程变换的调整大分子的大分子共识机制和时刻先后顺序的至关重要个人个人见解。

可以参考论文

Buenrostro J D , Corces M R , Lareau C A . Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.[J]. Cell, 2018.

效果展示英文

1. 细胞聚类

Cell Ranger ATAC 利用每个细胞的peaks 信息，运行cluster mode 对这些细胞进行分群。经tSNE 降维算法，得到细胞聚类的二维结果。

2. 的数据web3d

10X genomics公司提供的专门的分析结果查看软件-Loupe Cell Browser，该软件是一个图形界面的软件，操作非常的方便。可以用于以下应用：1.确定细胞类型: 使用可及性模式发现能够区分不同细胞类型和功能组别的启动子和转录因子motif；2.分析可及性差异: 使用ATAC Peak Viewer 定位具有假定调节功能的不同可访问基因组区域的位置；3.发现显著性特征: 创建自定义聚类并使用差异可及性分析工具精准识别数据中的细胞组别；4.共享数据结果: 保存感兴趣的信息，导出数据表，并获取单细胞ATAC数据的屏幕截图。