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【Nat Commun.】SARS-CoV-2 N淀粉酶增强NLRP3真菌感染小体缴活加重高炎响应

耗时：2021-11-10 点击率：
暨南大学吴建国教授/潘攀研究团队，在Nature子刊《Nature Communication》发表题为“SARS-CoV-2 N protein promotes NLRP3 inflammasome activation to induce hyperinflammation”（DOI: 10.1038/s41467-021-25015-6 ），该研究展示了SARS-CoV-2 N蛋白通过促进NLRP3炎症小体激活诱导高炎症反应；N蛋白促进促炎因子的成熟，并诱发细胞和小鼠的促炎反应；N蛋白直接与NLRP3蛋白相互作用，促进NLRP3与ASC结合，促进NLRP3炎症小体组装；N蛋白加重脓毒症和急性炎症小鼠模型中肺损伤，加速死亡，促进小鼠IL-1β和IL-6激活。
 

SARS-CoV-2 N球蛋白诱发細胞和小鼠促炎反應

应先，SARS-CoV-2染病巨噬細胞和树突細胞(DCs)后许多种促炎分子趋化分子及配体均有有差异度增长；设计工作员对SARS-CoV-2淀粉酶对IL-1β施放的的影响对其进行设计，WB结杲彰显N淀粉酶在HEK293T細胞表示极限(Fig.1c)，ELISA结杲彰显N淀粉酶表示的HEK293T-NLRP3疾病病变小体风险管理体系IL-1β极限(Fig.1d)，SARS-CoV-2 N淀粉酶全面提升Nigericin诱导型的IL-1β代谢(Fig.1e)。那么SARS-CoV-2 N淀粉酶在IL-1β旺盛期及代谢中起着注重的作用。N淀粉酶介导THP-1含盖IL-1β内的疾病病变分子表示， MCC950(NLRP3特异形缓和剂)不错缓和以上的疾病病变分子的表示(Fig.1g)。凭借AAVlung-N在小鼠肺中表达爱N淀粉酶，AAVlung-N能重要提高IL-1β，IL-6，TNF，CXLC10，CCL2，IL-11，IL-7和CXCL8的mRNA表述，别的Ac-YVAD-cmk(Caspase-1克药物，阻绝IL-1β发育成熟)和MCC950对AAVlung-N诱发的下列指数表达方法均有差异限度的修复目的(Fig.1h&1i)。由于，分析人数估测N蛋清增强NLRP3炎性小体系统成功激活，关键因素所在在于诱发成长IL-1β的分泌，因而在诱发感染指数和神经元指数中切实充分发挥关键因素所在目的。结果显示揭示，SARS-CoV-2 N蛋清在诱发促炎指数中切实充分发挥关键因素所在目的，N蛋清很有可能参与到转换NLRP3感染小体的系统成功激活。

 
Fig. 1 SARS-CoV-2 N蛋清诱导性疾病生理反应
 

SARS-CoV-2 N蛋白诱导IL-1β成熟和IL-6产生

要依赖于心潮澎湃剂对促炎因子表达的主导作用，接下来研究人员对SARS-CoV-2 N蛋白在IL-1β成熟中的作用进行研究。研究发现N蛋白可以促进IL-1β的分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1成熟且呈现剂量依赖，LPS+ATP和LPS+Nigericin均可诱导IL-1β的分泌和cleavage，N蛋白可以进一步促进IL-1β的分泌和cleavage(Fig.2a&2b)。LPS+ATP和LPS+Nigericin可以促进THP-1细胞IL-18和IL-6，N蛋白仅能促进IL-6的分泌，不能促进IL-18的分泌，MCC950抑制IL-1β和IL-6分泌；LPS+ATP或LPS+Nigericin同样可以促进BMDM细胞的IL-1β和IL-6的分泌，并且在NLRP3-/-小鼠BMDM中LPS+ATP或LPS+Nigericin对IL-6和IL-1β分泌并无显著促进作用(Fig.2c-2j)。综上所述，N蛋白诱导IL-1β的成熟和IL-6的产生，并揭示NLRP3是N诱导IL-1β分泌和IL-6产生所必需的，因此N蛋白可能在NLRP3炎症小体的激活中发挥重要作用。
 

Fig.2 N球蛋白诱导型IL-1β稳重和IL-6转化

 

SARS-CoV-2 N蛋白与NLRP3交互作用

反驳来探索者对SARS-CoV-2 N球淀粉酶在NLRP3支原体感染小体政策调控中的影响做探索。CO-IP导致提示，N球淀粉酶仅与NLRP3球淀粉酶主动影响，且His-N球淀粉酶行之间与NLRP3球淀粉酶结合实际(Fig.3a-3e)，N球淀粉酶和NLRP3共定位功能于受损细胞质中，N球淀粉酶与ASC无数据交互影响(Fig.3f-3i)。之所以，N球淀粉酶感染因子聊天与NLRP3球淀粉酶主动影响，自动调节NLRP3支原体感染小体分泌物。
 

Fig.3 SARS-CoV-2 N蛋白酶酶与NLRP3蛋白酶酶相互间功用

 

N蛋白参与NLRP3炎症小体激活

通过评估N蛋白的截短突变体N1-N8，鉴定参与NLRP3相互作用的SARS-CoV-2 N蛋白序列。结果表明，NLRP3蛋白与N1、N5、N6和N7相互作用，并且IL-1β分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1 p20 maturation 亦受N蛋白N1、N5、N6和N7影响(Fig.4a-4e)，因此，N蛋白260aa-340aa截短体参与了与NLRP3的相互作用并激活NLRP3炎症小体。
 


 

Fig.4 N血清截短体进行NLRP3慢性炎症小体刺激
 

N蛋清提高NLRP3与ASC的彼此做用

收起来科研人数对N蛋清在上下调整NLRP3感染小体化学物质中的用途进行科研。毕竟体现 体现 ，N蛋清对NLRP3、Caspase-1和ASC的蛋清标准不影向，然后NLRP3会现实存在时N和ASC需要彼此之间间免疫体生殖细胞奠定(Fig.5a-5e)。由于，该毕竟体现 提升N蛋清、NLRP3和ASC六个蛋清或者转变成个多样化的N-NLRP3-ASC混合物。N蛋清增強NLRP3与ASC的彼此之间间用途在HEK293T和A549体生殖细胞并呈残留量依赖性(Fig.5f-5g)。也是，在PMA-differentiated THP-1-N体生殖细胞中，Nigericin促使 N蛋清在NLRP3会现实存在的现象下与内源性ASC彼此之间间用途(Fig.5h)。由于，SARS-CoV-2 N 促使NLRP3与ASC的彼此之间间用途。
 


 

Fig.5 N蛋白酶提高NLRP3与ASC的之间用
 

SARS-CoV-2 N淀粉酶加速NLRP3炎性小体形成

对NLRP3在神经元质中来位置市场品牌定位，NLRP3呈弥纤维状分布图图于神经元质，而SARS-CoV-2 N蛋清长期长期存在时，NLRP3呈聚合的色斑状(Fig.6a)，SARS-CoV-2 3a蛋清与NLRP3共位置市场品牌定位，但没办法进行色斑状聚合。SARS-CoV-2 N2和N8 截短体，互相分布图图在神经元核和神经元质中且没办法与NLRP3和共位置市场品牌定位，NLRP3在HEK293T神经元的神经元质中未进行色斑状聚合(Fig.6b&6c)。THP-1神经元中NLRP1分布图图与HEK293T神经元和A549神经元近乎共同，且N蛋清长期长期存在时，内源性NLRP3蛋清在神经元质中聚合进行色斑(Fig.6d&6e)。之所以，SARS-CoV-2 N蛋清应该驱动NLRP3支原体感染小体挽回体的进行。
THP-1血组织和BMDM血组织中，Nigericin畅快内源性ASC蛋清oligomerization，或者N蛋清也可以增进一种发生反应(Fig.6f&6g)。还有，HEK293T-NLRP3血组织分辨转染商品编码SARS-CoV-2-N蛋清以及其截短突变的体，ASC oligomerization被N1、N5、N6和N7蛋清系统激活，而免受N2、N3、N4、N8蛋清危害(Fig.6h)。全部，N蛋清回文序列260aa-340aa与NLRP3彼此之间帮助，增进ASC oligomerization。
 


 

Fig.6 N核蛋白加快NLRP3集中和ASC oligomerization

 
此外，研究人员还探究了N蛋白对NLRP3炎症小体复合物组装的影响。将HEK293T细胞或A549细胞共转染不同质粒，GFP同时分布于细胞核和细胞质中，NLRP3弥散状分布于细胞质(Fig.7a&7b(a-e));N蛋白和NLRP3表达时，NLRP3与N蛋白共定位，呈斑点状(Fig.7a&7b(f-j));GFP和ASC表达时，GFP与ASC同时分布于细胞核和细胞质中，并形成小的环状结构(Fig.7a&7b(k-o))；N蛋白和ASC表达时，N蛋白和ASC无法共定位(Fig.7a&7b(p-t))；GFP、ASC和NLRP3同时表达时，NLRP3和ASC共定位于细胞质并形成环状结构(Fig.7a&7b(u-y))；值得注意的是，当N蛋白、ASC和NLRP3同时表达时，3种蛋白共定位形成球状结构(Fig.7a&7b(z-d))；当3a、ASC和NLRP3同时存在时，3种蛋白共定位未能形成球状结构(Fig.7a&7b(ae-ai))。综上所述，SARS-CoV-2 N蛋白促进NLRP3炎性小体复合物折装，而非SARS-CoV-2 3a蛋白。
 


 

Fig.7 N核蛋白力促NLRP3炎性小体組裝

 

N核蛋白激活码NLRP3发炎小体诱导型小鼠肺伤害

接下去来，论述员工对SARS-CoV-2 N淀粉酶酶在修改密码NLRP3感染小体的生物技术学能力做出判断。进行在C57BL/6小鼠展示N淀粉酶酶，研究性学习N淀粉酶酶在肺挫裂伤中的能力。肌内注射AAVlung-N的小鼠，血清中IL-1β和IL-6的能力强烈多于对比组，且Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制作用该反映(Fig.8a&8b)，但AAVlung抒发N球蛋白尚未印象血清中IL-18的抒发(Fig.8c)。AAVlung患上的小鼠肝部天然免疫荧光后果出现，AAVlung-N小鼠肝部IL-1β和IL-6呈现显著的不低于其它的分成小组，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可有效降低IL-1β和IL-6呈现(Fig.8d&8e)。HE脱色表明，带上AAVlung-N的小鼠肺脏有明星的的炎症病损病损及安排结构板材损害，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可可以抑制肺安排结构的病损(Fig.8f)。那些结杲揭示NLRP3炎性小体是N蛋清引诱的小鼠肺板材损害会出现所必不可少的。
 


 

Fig.8 N淀粉酶激活开通NLRP3宫颈炎症小体成脂小鼠肺挫伤

 
ELISA结杲体现 ，AAVlung-N诱导NLRP3+/+小鼠IL-1β和IL-6的表达，在NLRP3-/-无明显影响，说明NLRP3在N蛋白介导的IL-1β和IL-6激活中不可或缺(Fig.9a&9b)，对IL-18激活没有影响（Fig.9c）。并且携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺组织免疫组化结果IL-1β和IL-6的表达明显高于NLRP3-/-小鼠(Fig.9d&9e)。HE病理染色同样显示携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺部有明显的炎症病变及组织损伤(Fig.9f)。因此，N蛋白通过激活NLRP3炎症小体诱导小鼠全身炎症，引发肺损伤。
 


 

Fig.9 NLRP3在N蛋白酶诱发的肺受损中起关键性影响

 
综上上述情况上述情况，钻研员反映了COVID-19的方面的问题制度化，这里面SARS-CoV-2 N淀粉酶借助有利于会NLRP3发炎小体的重置得以有利于会发炎和肺里问题。
 


 

Fig.10 N淀粉酶借助激活卡NLRP3细菌感染小体诱导型肺影响建模方法

 

得出结论
 

 

在该探索中，探索专业考生确认解析GEO数据库(GSE155106)显示SARS-CoV-2感然巨噬生殖人体细胞和DCs会利于大量生殖人体细胞因素和趋化因素的描述。确认淘汰，探索专业考生显示SARS-CoV-2 N核蛋白质酶确认激话NLRP3炎性小体，利于支原体感染因素的描述引起小鼠肺受损，加剧脓毒症建模 小鼠的窒息死亡。N核蛋白质酶单独与NLRP3效应，利于NLRP3炎性小体聚合反应，进而激话NLRP3炎性小体。上面经验，该探索效果验证SARS-CoV-2 N核蛋白质酶确认NLRP3支原体感染小体介导肺受损的新管理机制。

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