有“毒”？内内毒素—rAAV媒介的“毒”中“毒”

内黑色素(Endotoxin)：又称之为脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，由脂质A、菌体特喜欢的人多糖和非特喜欢的人核心区多糖3部分组合而成，是革兰氏阴细茵内部壁内壁的组成的的成分，企业EU/mL。内黑色素对宿体是有毒的性的，脂质A是内黑色素的主要致癌性成分。
 

图1 内黑色素氧分子组成（红色方框表达,照片渠道规范论文资料4）

内毒素的释放是由细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时造成的，也会发生在正常细胞生长和分裂过程中。在rAAV载体制备过程中，内毒素污染主要有两种来源：细菌内毒素和环境内毒素。由于rAAV生产所需要的质粒DNA是从大肠杆菌中分离提取的，因此质粒DNA可能含有少量内毒素；同时，rAAV制备过程中需转染293T细胞，而细胞的生长分裂可能也会带来内毒素的产生；此外，生产过程中的环境污染可能亦会引入内毒素。

内毒素对宿主是有毒性的，即使是少量的内毒素也可能会诱导宿主产生免疫反应。内毒素可以与细胞膜上的受体结合引起免疫反应，激活组织内的炎性细胞和炎症因子的释放，对细胞有较强的毒性作用，影响体内外细胞的生长和功能。在体内环境下，内毒素作用于哺乳动物，可导致机体发热，引发全身性炎症反应，继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功能衰减等，最终导致死亡。因此，无论是涉及病毒载体的实验研究还是临床应用，我们都需要尽量去除载体的内毒素。

在病毒的生产中，内毒素的去除包括亲和层析、缓冲液洗涤等方法，亲和层析法去除内毒素具有耗时、成本高、载体回收率差等缺点。缓冲液洗涤法则是借助超滤或离子交换色谱分离LPS胶束，经过多次缓冲液交换洗涤，再用低速离心浓缩病毒培养液的方式去除rAAV载体内毒素，该方法目前在部分rAAV血清型中适用。无论哪种方法都有一定的局限性，因此，从源头上去除内毒素至关重要。

应用场景多年、30000+的病菌种植技术 ，银河集团官网 怪物保持优化调整病菌种植全步骤，搭建标准三级细胞库，每月更换细胞，保证代次，持续降低rAAV载体的内毒素；的同时，我们大家选定 GMP级的质粒完成病毒包装，从源头上控制内毒素的产生。在实际工作中，多次、随机检测的rAAV载体内毒素含量均＜2.5EU/ml，残留标准超出行业普遍的<10EU/ml，为研究者提供更好的基因载体，让基因递送触手可及。