在进行分子表达操控中，经常听到或使用到的一个技术便是Cre/Loxp或Flp/FRT重组酶系统。简单来说，这类重组酶系统是通过特异位点重组酶(Site-specific recombinases, SSRs)介导重组酶特异识别位点(Recombination tar-get sites, RTs)间的重组，来实现特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位等操作。由于该技术能够有效克服其他类型重组技术的非特异性或重组效率低等缺点，近年来已逐渐在功能基因研究领域占据了主导地位。
Cre-loxP的基本原理
Cre（Cyclization Recombination Enzyme）有的是种合拼酶，原因于P1噬菌体，其遗传表观遗传标识号区回文编码序列总长1029bp，为38kDa长宽比的、由343个核苷酸形成的多肽一人蛋白酶。Cre合拼酶的C-尾端设计域涉及到催化氧化氧化化学活化位点，并能催化氧化氧化DNA原子核中特殊位点相互间的合拼，并且，Cre还能设别特异的DNA回文编码序列，即loxP位点，使3个loxP位点间会发生遗传表观遗传合拼。
LoxP是Locus of X-overP1的缩写，是位于P1噬菌体中长度为34bp的一段序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，反向回文序列是Cre重组酶的识别和结合区域，间隔序列决定LoxP序列的方向。
Cre/loxP诱导基因重组的方式
一般而言，当细胞基因组内存在两个LoxP位点时，Cre重组酶会诱导两个LoxP位点间的序列发生重组。重组的结果取决于两个loxP位点的方向，主要有以下几种可能：
① 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地删除两个LoxP位点间的序列（Deletion）（图1A）；
② 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（Inversion）（图1B）；
③如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位，即基因转座（Translocation）（图1C）
④如果四个loxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能诱导loxP间的序列互换（cassette exchange）（图1D）。
图1 Cre-loxP诱导基因重组的方式
Cre-LoxP系统可以实现对基因的操控，根据Cre重组系统诱导基因重组的方式，我们可以通过如下三种策略实现Cre依赖的基因表达：
01 LSL序列（条件性基因选择）
将LoxP2和转录停止表现盒（Transcription STOP cassette）插入图通电子和目的性基因遗传两者，转录停止表现盒两端具有其中一个同相的LoxP位点，构成LoxP-STOP-LoxP-gene格局，即LSL字段。
此情况下，在无Cre酶存在的细胞中，转录终止信号盒下游靶基因完全不表达，但如果细胞中含有Cre酶，基因重组中的Deletion过程发生，移除转录终止信号盒，进而表达目的基因。这是一种简单有效的办法，我们可以通过LSL的设置，有选择性地在某些细胞中表达基因。
02 DIO/DO序列
利用对接一对不相融的交叉Lox位点LoxP和Lox2272，过程2组Lox位点的二轮协同led光通量到另一种稳定性工作状态。也即使是可以利用Cre协同酶的会存在是否来调控人类基因的把你想表达出来。
这种策略被称为DIO（Cre-on）或DO（Cre-off）。在这种策略下，任一对Lox位点间的序列会在Cre的作用下发生可逆的快速翻转，之后Cre重组酶马上不可逆地切割翻转后的同向Lox位点，只留下翻转后的基因和单独的LoxP、Lox2272位点，防止基因的再次翻转。这种巧妙的设计让科研人员可以在病毒载体中构建DIO和反向基因，感染Cre阳性细胞后，可以让Cre阳性的细胞表达基因，是为DIO结构；如果预先包装的基因是正向，那么Cre阳性的细胞则不表达基因，其余细胞表达基因，是为DO结构。因此，人为操控基因表达变成了现实。
图3借助LoxP和Lox2272的FLEX策略实现Cre依赖的基因表达
（Scott M. Sternson, et al., J. Neurosci., 2008）
03 MADM系统
双箭头嵌合体数据分析MADM（mosaic analysis with the double markers）模式，是为Cre诱导型性产生Translocation方式进行的。实现同源从组方案将俩个双方嵌合的箭头DNA（荧光球核血清）依次分析到同源复染体上的类似位点，为于统一条DNA链上的荧光球核血清N端（C互联网）和另个种荧光球核血清N端（C互联网）相互间放入一款 Loxp位点。在无Cre的情況下下，不传达交叉性性的GFP或RFP；但在某一时期、某受损组织组织受损上皮细胞膜系中传达Cre时，Cre能诱导型性代有俩种不同于荧光球核血清N下DNA链与另个条代有类似荧光球核血清C互联网的DNA链在受损组织组织受损上皮细胞膜系有丝分化G2期产生从组方案，可使得俩个子代受损组织组织受损上皮细胞膜系依次传达有某个种有交叉性性的荧光球核血清（称作：X-segregation），还是这其中一款 子代受损组织组织受损上皮细胞膜系传达俩种荧光球核血清而另个图片种子代受损组织组织受损上皮细胞膜系没有任何的交叉性性荧光球核血清（称作：Z-segregation）。时候，从组方案也有机会产生在受损组织组织受损上皮细胞膜系周期性的G1期还是G0期，在本身情況下下，受损组织组织受损上皮细胞膜系时候传达俩种荧光球核血清。
图4 MADM系统
（Zong Hui, et al., Cell., 2005）
Cre/loxp系统的应用
能够细菌加入Cre或loxP开关元件，融入属于转表观遗传小鼠电动车续航到对某类组织细胞使用特异形箭头或表观遗传操作使用的最终目的。LSL策略应用
mT/mG（ROSA-pCA-loxp-mT-pA-loxp-mG-pA）鼠是一种双荧光报告鼠，这种鼠在正常情况下表达定位在膜上的红色荧光蛋白（TdTomato），而当细胞表达Cre后，则表达定位在膜上的绿色荧光蛋白（GFP）。
Alb（血清蛋白）为肝实质细胞特异性启动子，将rAAV2/8-Alb-Cre病毒尾静脉注射mT/mG小鼠，可发现特异性感染小鼠肝脏组织（绿色），而心脏组织未被感染（红色）。
| 病毒产品 | rAAV2/8-Alb-Cre |
| 实验动物 | mT/mG鼠 |
| 注射方式 | 尾静脉注射 |
| 感染部位 | 肝脏组织 |
| 病毒用量 | 2E+11VG/只 |
管吉松教授团队将AAV-hSyn-Cre注射于 Ash1lfl/fl小鼠右侧AUD区条件性敲除Ash1l基因，发现Ash1l以细胞自主效应的方式介导皮层神经元的活动依赖的突触修剪过程。（）。
图6 AAV-Cre注射Flox小鼠实现条件性敲除
（Yan Yuze, et al., Neuron., 2022）
| 病毒产品 |
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE pAAV-hSyn-Cre-WPRE |
| 实验动物 | Ash1lfl/fl小鼠 |
| 注射方式 | 脑定位注射 |
| 感染部位 | 小鼠右侧脑AUD区 |
| 注射体积 | 300nL |
DIO策略应用
Thy1是锥体神经末梢元的特异形重新启动子，在前脑、海马、甜杏仁核、丘脑及眼角膜等区域内均有充足的表达出， Thy1-cre鼠做好rAAV质粒可在以上的脑区进行癌细胞特异形标出、光基因遗传基因遗传遗传规律学和物理化学基因遗传基因遗传遗传规律学操控、在体钙激光散斑记录好，也可以组建特异形的基因遗传添加图片。
| 病毒产品 | rAAV2/9-Ef1a-DIO-mCherry-WPRE |
| 实验动物 | Thy1-Cre小鼠 |
| 注射方式 | 脑定位注射 |
| 感染部位 | 小鼠双侧海马 |
| 注射体积 | 200nL |
图8 Cre-DIO系统结合病毒示踪技术实现对特异环路标记及调控
（Ma Hui, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2021）
| 病毒产品 |
rAAV2/Retro-CaMKIIα-mCherry-Cre rAAV2/9-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-GFP |
| 实验动物 | 小鼠 |
| 注射方式 | 脑定位注射 |
| 感染部位 | 小鼠vCA1和pBLA |
| 注射体积 | 200-300nL |
MADM系统应用
充分运用心肌组织系系特异形运行子Tnnt2驱动包cre酶的表达方法，合作MADM-ML-11TG/GT鼠探测心肌组织系系组织系系瓦解的情形。（）。
图9 MADM系统应用
（Du Jianyong, et al., Cell Stem Cell., 2022）
| 病毒产品 | pAdeno-Tnnt2-Cre |
| 实验动物 | P3 MADM-ML-11TG/GT鼠 |
| 感染部位 | 原代心肌细胞感染 |
Cre病毒列表（部分）
改造的Cre/loxP系统
经过现代基因工程方法对Cre和loxP元件的改造，Cre/loxP系统实现了更加丰富的条件性重组策略。
1、对Cre元件的改造：对Cre元件的改造提高了Cre重组酶的活性，并且实现了药物可诱导性。例如，通过在Cre元件上引入真核细胞核定位序列NLS，Cre重组酶能在低表达丰度下实现重组，这对于一些低丰度的启动子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造过的配体结合结构域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD将定位在胞浆内，当人工合成的激素分子结合到Cre-LBD受体后，蛋白构象改变并进入核内，介导基因重组，目前使用最多的是tamoxifen诱导的CreERT2突变体，它的LBD来自于雌激素受体ER分子，当有tamoxifen的时候，Cre才能介导基因重组，这样通过控制tamoxifen的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控。
图10 tamoxifen诱导的Cre-ER系统
（Hyeonhui Kim, et al., Lab Anim Res., 2018）
2、远红外光诱导的split Cre-loxP体系：化学诱导的Cre-loxP具有细胞毒性、泄漏、脱靶等劣势，华东师范大学叶海峰研究员团队基于split-Cre重组系统和远红外光(FRL)可诱导光遗传系统建立了远红外光诱导的split Cre-loxP体系(FISC，far-red light-induced split Cre-loxP system)。在该体系中，Cre酶被分为两个片段，N端Cre融合到一个Coh2结构（CreN-Coh2）；C端Cre融合到一个DocS结构（DocS-CreC）;FRL光照时，Coh2和DocS在强亲和力的作用下结合，从而Cre酶也被重新组合，行使功能。该体系实现了条件性非侵入的基因调控目的。（）。
图11 FISC体系
（Wu Jiali, et al., Nat Commun., 2020）
3、对loxP元件的改造：loxP元件也有一些突变体，间隔区和回文序列都可以进行突变，突变后的序列依然能被Cre重组酶识别和重组，但是突变的loxP序列必须和同样突变的loxP序列匹配介导基因重组，而不能和未突变的loxP序列匹配，这样将不同的loxP序列组合用于控制多个基因（如上文所述的lox2272位点），在同一Cre重组酶的作用下，可以实现多序列的基因重组，产生非常多元的重组结果。例如彩虹脑（Brainbow）技术绚丽多彩的荧光标记效果正式基于对loxP序列的改造实现。
其他重组酶系统
除Cre-LoxP开发外，之类的还是与Cre-LoxP开发无对称影响到的vCre-vLoxP、sCre-sLoxP开发，及Flp-FRT/F5开发和Dre-Rox1/Rox2开发，相对应的的把你想表达出来预案各是为fDIO和dDIO开发。多种资产从组酶模式的存在的为研究探讨中开发各个禁止能力展示 了生活便利，灵敏选用Cre、Flp、Dre资产从组酶开发将有利于太深入问题的做好（）。
图12 Cre\Flp\Dre系统比较
（Lief E Fenno, et al., Nat Methods., 2014）
参考文献
[1] Front Genet. 2016 Feb 19;7:19. doi: 10.3389/fgene.2016.00019.
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[3] Nat Methods. 2014 Jul;11(7):763-72. doi: 10.1038/nmeth.2996.
[4] J Biol Chem. 2020 Jan 17;295(3):690-700. doi: 10.1074/jbc.RA119.011349.
[5] J Neurosci. 2008 Jul 9; 28(28): 7025–7030.doi: 10.1523/JNEUROSCI.1954-08.2008
[6] Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147.
[7] Nucleic Acids Res. 2004 Nov 18;32(20):6086-95. doi: 10.1093/nar/gkh941.
[8] Dis Model Mech. Sep-Oct 2009;2(9-10):508-15. doi: 10.1242/dmm.003087.
[9] Nucleic Acids Res. 2011 Apr;39(8):e49. doi: 10.1093/nar/gkq1280.
[10]Cell. 2005 May 6;121(3):479-92.doi: 10.1016/j.cell.2005.02.012.
[11] Nat Commun. 2020; 11: 3708. doi: 10.1038/s41467-020-17530-9
