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基因表达调控是生物体内基因表达的调节控制，在疾病研究领域，基因表达调控几乎是所有生物学过程的基础。细胞水平上对目的基因的导入方式根据基因调控的时间长短可分为瞬时转染和稳定转染，实验中多会选择稳转的方式构建稳定表达细胞株，避免瞬转效率不同以及瞬转细胞传代过程中目的基因丢失等原因对实验造成误差。

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稳定细胞株的构建方法

稳定转染原理：特定基因或干扰特定基因的序列整合至宿主的基因组染色体中，不会随着细胞的增殖分裂而消失，在宿主细胞中可以稳定表达目的序列。通常，人们借助慢病毒能够整合序列到宿主基因组的能力来完成基因的稳定表达或稳定干扰。

  打造安全稳定株步骤之一详细（以Saos-2血细胞特征分析）：

1) 细胞铺板

将Saos-2内部按30%会合度育苗到6孔板：

① Saos-2细胞配成2.0×10⁵cells/mL细胞悬液，待铺板。

② 每孔铺2mL，即4×10⁵cells/well，铺1个6孔板。

2) 感染慢病毒

内部铺板后12-20h感梁hiv病毒

① 加病毒量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10³=病毒用量（μL）

②加polybrene：神经细胞原辅料中polybrene终有机废气浓度为5μg/mL。 ③ 疫情感化12-20h后换教育细胞提升液：弃去教育细胞提升液，每孔加进2mL新鮮的教育细胞提升液。

3) 稳定株筛选

① 72h后期，加如终盐浓度值2μg/mL puromycin。间隔2-3d换一回终盐浓度值2μg/mL puromycin清爽教育细胞培养液。 ② 药品建立约半个月后，拍荧太阳光片。 ③ 安全稳定細胞株认定和冻存。 注：别的上皮细胞的polybrene浓硫酸质量浓度及抗菌药浓硫酸质量浓度是需要做预调查设定设定。   

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不同基因调控策略的选择

基因表达的调控可在多个层面上进行，包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控，我们日常提及的基因调控多指基因及转录水平的上调和下调。基因的上调又可分为外源过表达和内源性激活CRISPRa（如表一），当目的基因序列过长，载体容量受限时多会选择内源性激活的方式实现目的基因上调。CRISPRa是利用CRISPR/Cas9系统，突变Cas9蛋白切割DNA的活性位点,使Cas9蛋白丧失切割DNA功能但依然保留与DNA结合的能力——称之为“d-Cas9”，d-Cas9连接激活元件（VP64）通过gRNA引导至目的基因的转录起始位点，便可实现目的基因的转录激活。

  表一：外源过呈现与内源性激发的差别

  人类DNA组组的下降一样 也会通过RNA干拢（RNAi）能力，凭借双链RNA（dsRNA）优质、特情人可降解内部内同源mRNA而中医靶人类DNA组组描述。但RNAi能力对靶人类DNA组组的削除是压根的，想要压根削除须得运用CRISPR/Cas9能力达成人类DNA组组的敲除，可可根据实验报告需求量进行RNAi可能是人类DNA组组敲除（如表二）。   表二：什么是基因缄默五种手段有点

  dna再降也都能够 选择内源性克制CRISPRi原则，与CRISPRa的基本原理是类似的，“d-Cas9”与dna克制型式特征域（KRAB型式特征域）重构理解，完成gRNA的引导系统可保证 原则dna的转录克制。CRISPRi原则的优越性是在于都能够 不变更内源dna组字段、有较高平均水平的dna克制功效、特异形更强且不适用编号规则或者非编号规则等四用途型的dna。   的选择适合使用的什么是染色体调节对策，推动慢病毒样本形式优化什么是染色体的业务能力，立刻来创设稳转株吧！今天精心安排处理了银河集团官网 用户广泛应用有差异 调节什么是染色体对策的探析方案技术成果，以求为科研课题人er带来了新的探析方案设想！   

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银河集团官网 客户案例分享

1) 过表达＆干扰

句子标题文字：Hypoxia-induced circRNF13 promotes the progression and glycolysis of pancreatic cancer 研究方案东西：糖酵解（胰腺癌）

发表期刊：Exp Mol Med. IF：12.153

肿瘤细胞性质：SW-1990（过形容circRNF13）/MIA PaCa-2（影响circRNF13） 质粒个人信息：pGLV31H1-Luci-circRNF13-OE/LV-shcircRNF13/LV-NC

克隆形成实验检测稳定过表达或稳定敲低circRNF13会正向调控PC细胞增殖(图A-D)。稳定细胞株构建肿瘤异种移植模型来验证circRNF13在体内的作用。结果显示，circRNF13过表达显著加速肿瘤生长，肿瘤体积和最终肿瘤重量显著增加(图E-H)，而circRNF13敲低组的肿瘤体积和重量低于对照组(图I-L)。皮下肿瘤组织的免疫组织结果表明，Ki-67在circRNF13过表达肿瘤中的表达高于对照肿瘤(图M)。同时CD31（血管生成的生物标志物）阳性细胞在circRNF13过表达的肿瘤中的百分比高于对照肿瘤(图M)。在circRNF13敲低的肿瘤中的结果与之相反。为了进一步确定circRNF13在PC血管生成中的功能，过表达circRNF13  SW-1990细胞的条件培养基增加了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的管形成。相应地，敲低circRNF13 MIA PaCa-2细胞的条件培养基在很大程度上损害了血管生成能力(图N)。综上所述， circRNF13在PC增殖和血管生成中起重要作用。

图1. CircRNF13在身体之外和体内的促使PC繁殖和血栓出现  

2) 内源性激活

论文版头：PTENα and PTENβ promote carcinogenesis through WDR5 and H3K4 trimethylation 研发网站内容：癌肿发现考核机制

发表期刊：Nat Cell Biol. IF：28.231

组织内型：293T（内源性修改密码USP9X） 的载体讯息：LV-dCas9-Puro，LV-gRNA（USP9X/WDR5/PTEN3/PTENα/β）

对50例肝癌患者的肿瘤组织和相应的癌旁组织进行免疫印迹检测，发现PTENα/β与PTEN蛋白在肝癌中的表达不一致。与癌旁组织相比，在一些PTEN减少的肿瘤组织中，PTENα/β的表达保持不变，甚至增加(图A，B)。PTENα和PTENβ对蛋白酶体介导的降解较PTEN更敏感。研究通过优化电泳策略分离PTENα和PTENβ，发现PTENα和PTENβ都比PTEN更不稳定(图C)，蛋白酶体抑制剂MG132和PS341相较于溶酶体抑制剂NH4Cl或Brefeldin A显著积累了PTENα/β (图D)。Co-IP结合LC−MS/MS鉴定了3个E3连接酶或去泛素化酶(USP9X、USP7和TRIM28) 和PTENα相互作用的蛋白。通过干扰（shRNA）或敲除（CRISPR-Cas9）技术下调USP19在293T和Hela细胞中的表达会导致内源性PTENα/β的降低，而不影响PTEN的表达（图E-G）。相反的是，瞬时过表达USP9X和通过CRISPR-dCas9对USP9X进行的稳定转录激活均增加了293T细胞中的PTENα/β(图H,I)，但未增加PTEN蛋白。综上，USP9X正向调节PTENα/β，但不调节PTEN蛋白的表达。

图2. PTENα和PTENβ在肝癌中的展现与PTEN蛋清不不符，且受USP9X的管控  

3) 内源性抑制

短文小标题：Human forebrain organoids-based multi-omics analyses reveal PCCB's regulation on GABAergic system contributing to schizophrenia 研究分析一下方面：奉献精神分列多个学分析一下

发表期刊：Research Square.

细胞系型：hiPSCs（内源性缓和PCCB） 平台新信息：pLV-hU6-sgRNA-hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro

PCCB编码丙酰辅酶a羧化酶的β亚基参与丙酰辅酶a28分解代谢的线粒体酶，PCCB突变可通过破坏三羧酸(TCA)循环来损害线粒体能量代谢。用PCCB稳定敲低的hiPSCs或对照hiPSCs产生的hFOs（Forebrain Organoid，大脑类器官）来研究敲低PCCB对功能的影响。结果显示，在细胞氧化磷酸化中起作用的几个线粒体基因MT-ND2、MT-ND5和MT-CYB，在PCCB-G1和PCCB-G2 hFOs中均下调(图A)。同时，PCCB敲低降低了hFOs中的ATP生成，增加了ROS水平(图B,C)，引起线粒体功能障碍。ELISA实验证实PCCB敲低降低了琥珀酰辅酶a (SCOA)和α-KG(图D,E)，当在hFOs的培养基中添加可转化为GABA的上游代谢物α-KG (10 μg/ml)，发现在PCCB敲低的hFOs中GABA水平恢复(图F)。研究表明，PCCB敲低通过减少TCA循环降低GABA水平(图G)。

图3. 敲低PCCB造成 hFOs线粒体用途心里障碍  

4) 单克隆敲除

散文题头：FBXO22 promotes leukemogenesis by targeting BACH1 in MLL-rearranged acute myeloid leukemia 探析內容：败血症

发表期刊：J Hematol Oncol. IF：23.168

生殖受损上皮细胞内型：THP-1人单核心生殖受损上皮细胞败血症生殖受损上皮细胞（敲除FBXO22） 平台数据：pLenti-U6-gRNA-mCMV-SaCas9-P2A-sfGFP（gFBXO22）

为了研究Fbxo22缺陷抑制AML进展的分子机制，通过免疫共沉淀(IP)结合LC-MS/MS分析探讨了Fbxo22在THP-1细胞中的相互作用。关注到氧化应激反应的调节因子BACH1为THP-1细胞中与FBXO22相互作用蛋白丰度最高的蛋白(图A)。在THP-1细胞中可以检测到内源性BACH1与FBXO22的相互作用(图B,C)。THP-1细胞用CRISPR/Cas9敲除FBXO22后构建单克隆株，发现BACH1的蛋白水平显著升高；shRNA敲低FBXO22使THP-1和MV4-11细胞中的BACH1稳定；并证实BACH1蛋白的增加与抑制BACH1的HO-1蛋白的减少相关（图D-F）。与此相反的是在THP-1细胞中，异位表达和诱导表达FBXO22显著降低BACH1蛋白和/或增加HO-1的表达(图G, H)。此外，放射线己酰亚胺(CHX)处理FBXO22敲除的THP-1细胞中BACH1蛋白的降低被显著阻断(图I)。进一步验证FBXO22是否通过蛋白酶体途径降解BACH1，显示，FBXO22的表达显著降低了BACH1蛋白的表达，而BFA和NH4Cl对该作用无明显影响，这表明FBXO22介导的BACH1降解受到蛋白酶体和CRL复合物调控（图L），并且FBXO22增加内源性BACH1蛋白的泛素结合物的丰度，反之FBXO22敲除降低了THP-1细胞内源性BACH1泛素化(图M,N)。这些结果表明，在MLLr AML细胞中，FBXO22与BACH1相互作用并促进BACH1的降解。

图4. FBXO22在MLLr AML人体细胞中有利于BACH1的分解  

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