Neuron | 挽回小星星的儿子！上科大管吉松组证明ASH1L单倍不足之处致小鼠自闭症的感觉神经策略

交感脑神经体统脑神经体统体统的发育状况和学会诱骗的脑神经体统环路重新构建都面临遗传基因组理解的時空调节目的。组淀粉酶重新构建在人体生理和方面的问题环境调低节目的这一类遗传基因组的理解起侧重要目的，但是，组淀粉酶重新构建也许 成许许多多重点脑患病的潜在性的口服药靶点。

 

组蛋白甲基转移酶被确认为许多神经发育障碍的风险基因。Ash1l是一种组蛋白甲基转移酶，属于三胸家族（trxG）蛋白的成员之一，其能拮抗多梳蛋白家族对基因转录的抑制功能。目前越来越多的研究证明，Ash1l基因功能缺失是自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）发生的首要危险因素，然而，关于Ash1l单倍体不足导致与 ASD相关致病机制尚不清楚。

2020年一月份26日，沈阳新材料技艺高中生活科学学与技艺技术学校管吉松教授团队充分利用Ash1l缺少小鼠型号、情形学范式、光隐性基因学等另一个技木法律手段察觉到Ash1l单倍体不足之处出现小鼠ASD样情况，危害运动依靠的突触剪修步骤，并对该情况做出了整体性挑战，一些设计工作成果发刊在神经末梢有效高性价比中文核心期刊Neuron上，版头为ASH1L haploinsufficiency results in autistic-like phenotypes in mice and links Eph receptor gene to autism spectrum disorder

 

 

但是

 

 

前脑神经元Ash1l单倍体不足导致小鼠的ASD样表型

 

首先，作者比较了Ash1l^+/-小鼠[1,2]和WT小鼠的行为学表型，在Ash1l^+/-小鼠中检测到了单倍体不足，同时，旷场实验（the open-field test）和埋珠實驗（the marble-burying test）行为举动学范式最终显示信息，Ash1l^+/-小鼠突出表现这样纠结、重复使用呆板的的行为（图1A,B）。不但，对出世后7-9天（P7-P9）小鼠进行幼鼠超声发声测试，发现Ash1l^+/-小鼠在生命早期存在现沟通障碍的现象（图1C）。三箱人际交往检测（three-chamber assay）结果显示Ash1l^+/-小鼠也表现出社交障碍（图1D）。这些结果提示了Ash1l突变小鼠表现出典型的自闭症样行为，包括沟通困难，重复刻板行为、社交障碍等。

 

单细胞基因表达分析发现，在中枢神经系统中， Ash1l优先在神经元中表达（图1E）。为此，钻研工作员有效利用原位杂交育种链式影响（HCR-FISH）做进一步验证，发现在皮层神经元中，Ash1l阳性信号与Map2阳性信号（(Map2⁺，周围神经元因素物）长度重合（图1F）；在Map2^-细胞中，Ash1l信号点数量明显减少。这提示了神经元中Ash1l功能缺失可能导致自闭症谱系障碍 (Autism Spectrum Disorder, ASD）样个人行为。

 

系统设计给出結果，诗人共建Ash1l^Emx1-cKO小鼠（特异性在前脑，特别是新皮层和海马区敲除Ash1l,图1G-I），并通过行为学范式发现，前脑Ash1l单倍体不足导致小鼠ASD样行为（图1J-L）。
 

图1 Ash1l单倍体不足导致小鼠的ASD样表型

 

 

Ash1l突变小鼠存在辨别能力缺陷

 

接下来，研究人员对Ash1l缺失小鼠的学习行为进行评估，借助条件性恐惧反射范式发现，Ash1l^+/-小鼠和WT小鼠均学会了情境性恐惧条件反射，并表现出类似的恐惧记忆重提水平，然而Ash1l^+/-小鼠在恐惧学习的第三天表现出木僵行为（freezing, 大老鼠的1种防御力反映）下降；此外，在Ash1l^+/-小鼠中未观察到两种不同环境下的木僵行为差异（WT小鼠在context A中成绩出较高的木僵现象，在context B（新学习环境）中成绩出较低的木僵现象），提示了Ash1l^+/-小鼠辨别能力受损（图2A,B）。

 

在唱音依赖性的辨认范式（图2C-E）和依托于高音的Go-No-go个人行为范式（图2F-H）中，Ash1l^+/-小鼠同样表现出明显的听觉辨别障碍（听觉脑干反应（ABR）测试Ash1l^+/-小鼠无明显的听力损失）。

 

为了验证前脑神经元中Ash1l缺失是否会导致与Ash1l^+/-小鼠类似的辨别能力障碍现象，作者借助Ash1l^Emx1-cKO小鼠进行相关行为学范式，发现Ash1l^Emx1-cKO小鼠与惧怕记忆英语相关内容的痛觉分辨效果明显的损毁（图2J,K）。这种Ash1l突变小鼠的辨别能力异常符合部分ASD患者的临床表现。前脑Ash1l缺失可导致突触和神经环路功能障碍，以及辨别行为障碍。
 

 

图2 Ash1l^+/-小鼠表现出正常的学习能力，但辨别能力受损

 

 

Ash1l以细胞自主效应的方式介导活动依赖的突触修剪过程

 

随后，作者借助高尔基染色发现，1月龄的Ash1l^+/-小鼠皮层神经元和背侧纹状体中棘神经元（MSNs）的树突棘溶解度明显增强（图3A），为学习这类现像是否有在于突触削除时候（synapse elimination）的减少，研究人员研究了Ash1^+/-小鼠原代皮层神经元的突触密度变化。用表达ChR2光敏蛋白的慢病毒载体（Lenti-CaMKIIa-ChR2）感然塑造的周围神经元，合用LED有趣（图3B），发展WT感觉神经元在LED刺激作用后24h树突突触素（SYP）密度显著降低，而Ash1l^+/-组则未观察到这种现象（图3C,D），提示了Ash1l可能介导了活动依赖的突触修剪过程。活体成像结果显示，Ash1l^+/-组培养的神经元中，活性依赖的突触消除过程被削弱。

 

不但，写作者还探讨了在小鼠新皮层中活力依赖于的突触清理，侦测了听觉系统皮层（auditory cortex, AUD）到后顶叶皮层（posterior parietal cortex, PTLp）长长度投映轴突的改变。论述人将AAV-EF1a-DIO-EYFP打针在Rbp4-Cre小鼠AUD，特情人箭头触觉皮层L5神经系统元（图3H）。小鼠接受音调依赖的恐惧条件训练，成像观察轴突变化发现，声调依赖的恐惧条件学习24h后，Ash1l^+/-::Rbp4-Cre小鼠“bouton”（突触总结ppt）的彻底清除显眼远低于WT小鼠，而“bouton”构成则稳定不改（图3H-J）。

 

为探究这种“突触修剪”过程的缺失是否由Ash1l缺失神经元的细胞自主效应导致的，研究人员将AAV-hSyn-Cre和AAV-EF1a-DIO-EYFP注射于Ash1l^fl/fl小鼠右方AUD区（图3K），对小鼠进行音调依赖的恐惧条件行为学范式训练，在学习之后借助体内成像技术追踪突触的变化，发现Ash1l缺失的神经元中学习依赖的突触的增加数量没有发生改变，而学习诱发的突触的减少数量显著低于正常小鼠（图3K-M）。这些数据提示了Ash1l以细胞自主效应的方式介导皮层神经元的活动依赖的突触修剪过程。
 

 

图3 Ash1l以细胞自主效应的方式介导活动依赖的突触修剪过程

 

 

Ash1l调控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表达

 

接下去来，编辑探析了其分子式新机制，按照对转录多组分析及基因组精神力论（GO）分析发现，Eph受体EphA7在听觉皮层和背侧纹状体中的表达均显著下调（图4A-C），基于此，研究人员进一步将EphA7作为参与Ash1l介导的突触修剪过程的重要基因之一进行了研究。

 

Eph受体及其配体 Ephrin 统称为Eph家族蛋白，是蛋白酪氨酸激酶家族中的最大成员。Eph/ephrin蛋白作为细胞表面分子，参与调节突触的形成及神经元的可塑性，EphA7是编码Eph受体中14个受体蛋白基因之一，在皮质发育和突触功能中发挥重要作用。

 

随后，研究人员借助音调依赖的恐惧条件行为学范式，在体内/体外均发现Ash1l^+/-小鼠听觉皮层活动依赖的神经元中EphA7表达远低于WT小鼠的（图4D-I），提示了在Ash1l^+/-小鼠中EphA7活动诱导表达受损。
 

 

图4 Ash1l调控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表达

 

 

Ash1l通过拮抗EZH2-H3K27me3来调控EphA7的表达

 

进一步，作者探究Ash1l是如何参与调控EphA7活动诱导表达，通过染色质免疫沉淀技术（ChIP）发现，Ash1l的直接靶点H3K36me2在WT和Ash1l^+/-小鼠AUD EphA7基因位点附近没有明显差异，然而H3K27me3信号（组核蛋白甲基移动酶分手后复合体PRC2离子液体的调控性标签物）在Ash1l^+/-小鼠EphA7基因位点显著增加（图5A,B）。同时，Ash1l^+/-小鼠中H3K27ac（一名拉新的加强箭头。H3K27ac与H3K27me3共享资源一名具体位置，存在的拮抗影响。）表达出一直骤降，用NaB（组球蛋白去乙酰化酶克药物）预处理培养的神经元发现，刺激Ash1l^+/-神经元后H3K27ac升高，EphA7表达恢复（图5C,D）。同样地，行为学结果显示，Ash1l^+/-小鼠中H3K27me3、EZH2（PRC2和好体的同一个必要的催化反应酶）表达方式水平方向有效加入（图5E-G）。能够 UNC1999（EZH1/2调控剂）对培养的神经元进行预处理，发现Ash1l^+/-激活的神经元中EphA7表达受到抑制的现象得到改善（图5I）。上述结果提示了，Ash1l在活性依赖的PRC2介导的转录抑制累积中发挥拮抗作用，从而允许EphA7在激活的神经元中表达。

 

图5 Ash1l通过拮抗EZH2-H3K27me3沉默来调控EphA7的表达

 

 

EphA7高表达可改善Ash1l^+/-小鼠突触修剪过程缺陷和行为异常

 

基于上述结果，研究人员研究了提高EphA7受体活性是否能改善Ash1l突变小鼠的突触修剪过程缺陷和行为异常。Ephrin-A5是EphA7的高亲和力配体，参与下游信号[3,4]。我们在塑造培养的神经末梢元和小鼠感觉器官皮层中选用Ephrin-A5多聚体的Fc融为一体球蛋白（Ephrin-A5 Fc）直接刺激EphA7活性[5,6]，发现改善了Ash1l突变小鼠的突触修剪过程和行为异常（图6）。
 

 

图6 Ephrin-A5激活EphA7高表达Ash1l^+/-小鼠突触冬剪过程中 一些缺陷和行为表现系统异常

 

 

 

结论

本文借助转基因模型鼠、多种行为学范式、光遗传学技术、活体成像转录组分析及基因本体论分析等多种技术手段，研究发现前脑神经元Ash1l单倍体不足可导致小鼠产生沟通困难、重复刻板行为、社交障碍等类似自闭症样表型，并机制上破坏活动依赖的突触修剪过程，这是以细胞自主效应方式介导的。进一步研究发现，Ash1l可通过介导EZH2-H3K27me3去抑制作用提高EphA7的活性依赖表达，进而影响突触消除过程，并改善Ash1l^+/-小鼠辨别能力障碍及行为障碍。该研究有助于深入了解ASD相关发病机制，为其干预治疗提供了新的思路。

 

 

 

 

著者简介及股票基金图片信息

 

 

正在上科大管吉松教授课题组进行合作研究的2017级博士研究生闫宇泽(同济大家)和上科大生命学院的田苗苗博士为本文的共同第一作者。上科大生命学院研究生 2016级陈琪楠、2017级郭修贤、2018级李萌、2019级周罡也对本研究做出了重要贡献。管吉松教授、青岛大学附属医院刘世国教授和清华大学熊巍教授为本文的共同通讯作者，研究得到中科院遗传发育所吴青峰研究组、上海理工大学谢红研究组的大力支持。研究也得到了上科大戚炜教授、范高峰教授和上海交通大学医学院徐楠杰教授大量的有益帮助。

 

该学习会受到科持部科持什么是创新2030-大的投资的建设项目帮助，和生态地理学股权基金投资的建设项目已经西安市科委投资的建设项目适配。

 

银河集团官网 生物制品我幸提供数据进行实验中食用的AAV、慢病毒样本各种载体，用真正来加入推助中国内地脑数学的转型。

 

业务咨询

 

更多业务需求可长按或扫描下方二维码，填写表单，我们将尽快安排专人与您联系！

 

 

原句链接搜索:

//www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(21)01090-4

可借鉴获取

 

决定性文章

[1] Liu, S.G., Tian, M.M., He, F., Li, J.N., Xie, H., Liu, W.M., Zhang, Y.T., Zhang, R., Yi, M.J.,Che, F.Y., et al. (2020). Mutations in ASH1L confer susceptibility to Tourette syndrome. Mol Psychiatr 25, 476-490.

[2] Zhu, T., Liang, C., Li, D., Tian, M., Liu, S., Gao, G., and Guan, J.S. (2016). Histone methyltransferase Ash1L mediates activity-dependent repression of neurexin-1alpha. Sci Rep 6, 26597.

[3] Beuter, S., Ardi, Z., Horovitz, O., Wuchter, J., Keller, S., Saha, R., Tripathi, K., Anunu, R., Kehat, O., Kriebel, M., et al. (2016). Receptor tyrosine kinase EphA7 is required for interneuron connectivity at specific subcellular compartments of granule cells. Sci Rep 6,1451 29710.

[4] Nguyen, T.M., Arthur, A., Zannettino, A.C.W., and Gronthos, S. (2017). EphA5 and EphA7 forward signaling enhances human hematopoietic stem and progenitor cell maintenance,migration, and adhesion via Rac 1 activation. Exp Hematol 48, 72-78.

[5] Clifford, M.A., Athar, W., Leonard, C.E., Russo, A., Sampognaro, P.J., Van der Goes, M.S., Burton, D.A., Zhao, X.M., Lalchandani, R.R., Sahin, M., et al. (2014b). EphA7 signaling guides cortical dendritic development and spine maturation. P Natl Acad Sci USA 111, 4994-4999.

[6] Depaepe, V., Suarez-Gonzalez, N., Dufour, A., Passante, L., Gorski, J.A., Jones, K.R., Ledent, C., and Vanderhaeghen, P. (2005). Ephrin signalling controls brain size by regulating apoptosis of neural progenitors. Nature 435, 1244-1250.