供稿人：舒易来团队图片
2022年2月23日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来主任、李华伟教授与中国农业科学院（东莞）农业基因组研究所左二伟研究员等团队合作在Cell Research期刊在线发表题为“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究论文。该研究以腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）作为高效的基因治疗递送载体，转染听觉内毛细胞，用一种优化的HMEJ（同源臂介导的末端接合）的基因敲入方法精准修复Klhl18lowf耳聋模型的点突变，实现在体Klhl18lowf基因有效编辑，恢复感受声音的内毛细胞静纤毛形态，并纠正耳聋小鼠模型的听觉功能长达治疗后6个月。这是首位因为CRISPR/Cas9-HMEJ技术应用医疗隐性基因遗传规律性风骚音面神经性聋成就 的分析，为基因遗传规律性性耳聋的脱贫攻坚医疗同时临床实践和转化了出具了强力量的科学学直接证据。
据全球卫生防疫组识（WHO）官方主页曝光，已经达到全球排名人口结构的5%，即4.63000万人得病致残性口语障碍性，里面3400万是小孩。其实深入分析出现已经达到120个基因组与其标准化征型或标准化征型耳聋有关于（//hereditary hearing loss.org/），但临床药理上对待基因隔代遗传病性感诱惑音感觉神经性聋的开展抛开佩带扩音器和殖入人为耳蜗等，还没有任意合理的中成药开展方式方法。在非宗合征型基因隔代遗传病性耳聋中，常着色体隐性基因隔代遗传病性耳聋占80% (Korver et al., 2017)。
对隐性遗传性耳聋，更好的改善的方式是对人类什么是遗传基因转变位点来进行精细地清理，随之一辈子地恢复功能听写。CRISPR/Cas9人类什么是遗传基因编缉器平台是近些年里起源于的环保型人类什么是遗传基因编缉器器具，已在皮肤疾病的改善中突出表现出了强大的应运价值。该平台其一般由sgRNA和Cas9两个分类成，前两者生成挽回体， sgRNA与靶位点正向同质做到精准定位后，同样掌握PAM字段，Cas9核酸酶割切DNA，从而导致DNA发现断。上皮细胞内其一般有有两种DNA伤害清理规则，非同源后部连入（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源整顿修整（Homologous recombination，HR）。当有外源性DNA模版现实存在时，利用HR能够推动编码序列的多种精确性调节可能定向加上，但其工作成功率不够，尤其是在非分裂主义上皮细胞中，HR的工作成功率更低，这更大受限制了HR在基因组控制行业领域的技术应用。
钻研技术团队在仍然的钻研中通快递过在同源模板免费的两边形成sgRNA的靶位点，联合开发了种以同源臂介导的末段连结（Homology-Mediated End Joining，HMEJ）为根本的染色体敲入攻略 (Yao et al., 2017)，在身上、体内均达成了便捷而精密的推进（图1）。HMEJ介导的人类什么是DNA敲入的方法为包含人类什么是DNA小编植物模式的搭建和DNA性重大疾病的精准脱贫靶点人类什么是DNA疗法等可以提供了好的利润。迄今为止，目前还没有特征提取CRISPR/Cas9介导的HR措施确定耳聋人类什么是DNA疗法的身上学习。
图1 开发HMEJ同源协同改善方案怎么写。a 对於需求的sgRNA，开发HMEJ同源臂。b 系统结构AAV最为身体递送形式的双AAV改善系统，在当中一款AAV递送在把你想表明出来Cas9的形式，另一方面一款递送把你想表明出来sgRNA和挟带同源臂的形式。
Klhl18lowf小鼠模型
Klhl18lowf小鼠模型是指Klhl18 p.V55F发生错义点突变（Chr9:110455454 C>A），其纯合子小鼠表现为第4周开始出现以低频为主的渐进性听力下降，随着年龄增长，听力下降逐渐累及其它频率，最后发展为全频型严重耳聋，而杂合子小鼠听力正常，表现为隐性遗传。Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠模型在形态学方面表现为耳蜗内毛细胞纤毛的形态异常 (Ingham et al., 2021)。
CRISPR/Cas9-HMEJ标准体系
该研究首先针对基因Klhl18lowf突变位点设计、筛选和构建了HMEJ治疗体系。在新生小鼠皮肤成纤维细胞中进行体外sgRNA筛选，发现sgRNA2的效率较高。将表达Cas9的质粒与携带HMEJ同源模板和表达sgRNA2的质粒共同转染至带有Klhl18lowf突变的成纤维细胞中，发现突变位点明显得到了的纠正，且sgRNA2不产生明显的脱靶编辑。
源于CRISPR/Cas9-HMEJ装修标准机体校验
体外实验证实设计的HMEJ系统可以精确纠正Klhl18lowf点突变后，该研究进一步在体内探索该系统的疗效。用双AAV包装CRISPR/Cas9-HMEJ基因修复体系，即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor，将其在Klhl18lowf新生鼠出生后1天（P1）显微打瘦脸针至小鼠的内耳。在小鼠P14和10周龄时，身体里文字编辑器顺利完成率论文检测毕竟发觉，双AAV进行治療软件系统在体顺利完成避免了Klhl18dnaC>A点变异，根据文字编辑器日子的加长，10周龄的修护顺利完成率提升了约3倍，而在未打瘦脸针耳中，没得关注到显然的碱基添加、异常或变异碱基的避免。能够 扫面电镜系统，与野生植物型小鼠较之，发觉8周龄的未进行治療纯合变异小鼠的内孔隙管胞更高第第一排静纤毛情况为更长、更细且最顶成尖细的椎型，而进行治療后的小鼠有环节内孔隙管胞的静纤毛康复通常情况情况的特性，情况为更高第第一排静纤毛大环节呈柱形且更短。在进行治療后小鼠耳蜗的顶圈和中圈，均值约16%的内孔隙管胞体现了通常情况情况或达到通常情况情况的纤毛束特性。听性脑干发应（auditory brainstem response, ABR）测试结果显示注射AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治疗体系后8周，注射耳的ABR阈值在8、16、24和32 kHz均比未注射耳明显下降，且治疗效果持续至小鼠24周龄（研究观察动物期）。电生理变化查重数据表明，在较长时光（200 ms）的去极化脉冲刺激条件下，未注射耳的内毛细胞膜电容与野生型相比明显下降，而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治疗体系能将注射耳内毛细胞膜电容恢复至野生型水平，即治疗体系修复了内毛细胞持续囊泡释放功能。
综上所述，基于CRISPR/Cas9-HMEJ策略可对体内内耳毛细胞中的基因突变位点进行精准的纠正，恢复了耳蜗部分内毛细胞静纤毛形态、修复了内毛细胞持续囊泡释放功能并持久改善了Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠的听觉功能，为最终在人类隐性遗传性耳聋及其它器官系统隐性遗传性疾病中实现安全、持久的基因治疗提供了科学依据和参考。
复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来研究员、李华伟教授和中国农业科学院（山东）农业基因组研究所左二伟研究员为共同通讯作者，顾晰博士后、胡新德博士后（我们学科院周围神经学科科研所）和王大奇医生后为一同一、小说家。
