Neuron | 营救天上的星星妻子儿女！上科大管吉松组反映ASH1L单倍存在问题致小鼠自闭症的感觉神经制度化

中枢周围感觉神经周围感觉神经设计的發育和深造诱发的周围感觉神经环路构建都获得什么是DNA表述方式的超空间调整。组血清构建在生理方面和病必备条件下跌整例如什么是DNA的表述方式起特别要反应，从而，组血清构建也许 加入非常多关键脑病的隐性药品靶点。

 

组蛋白甲基转移酶被确认为许多神经发育障碍的风险基因。Ash1l是一种组蛋白甲基转移酶，属于三胸家族（trxG）蛋白的成员之一，其能拮抗多梳蛋白家族对基因转录的抑制功能。目前越来越多的研究证明，Ash1l基因功能缺失是自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）发生的首要危险因素，然而，关于Ash1l单倍体不足导致与 ASD相关致病机制尚不清楚。

2020年6月26日，南京科技有限公司院校健康专业与系统技术学校管吉松教授团队运用Ash1l缺少小鼠整治、攻击行为学范式、光基因遗传规律学等二个科技方式方法找到Ash1l单倍体欠佳诱发小鼠ASD样形为，严重破坏主题活动依耐的突触修枝的过程 ，并对该表现开始了软件全局性探讨，有关的钻研成果展刊载在感觉神经科学学最牛期刊杂志Neuron上，宝贝标题为ASH1L haploinsufficiency results in autistic-like phenotypes in mice and links Eph receptor gene to autism spectrum disorder

 

 

的结果

 

 

前脑神经元Ash1l单倍体不足导致小鼠的ASD样表型

 

首先，作者比较了Ash1l^+/-小鼠[1,2]和WT小鼠的行为学表型，在Ash1l^+/-小鼠中检测到了单倍体不足，同时，旷场实验（the open-field test）和埋珠测试（the marble-burying test）举动学范式最终结果提示 ，Ash1l^+/-小鼠表演近似于焦虑情绪、多次重复刻板活动的活动（图1A,B）。不但，对刚出生后7-9天（P7-P9）小鼠进行幼鼠超声发声测试，发现Ash1l^+/-小鼠在生命早期存在现沟通障碍的现象（图1C）。三箱社交app研究（three-chamber assay）结果显示Ash1l^+/-小鼠也表现出社交障碍（图1D）。这些结果提示了Ash1l突变小鼠表现出典型的自闭症样行为，包括沟通困难，重复刻板行为、社交障碍等。

 

单细胞基因表达分析发现，在中枢神经系统中， Ash1l优先在神经元中表达（图1E）。因为，探讨工作人员运用原位杂交种链式不起作用（HCR-FISH）做进一步验证，发现在皮层神经元中，Ash1l阳性信号与Map2阳性信号（(Map2⁺，运动神经元标志的意思物）超高交叠（图1F）；在Map2^-细胞中，Ash1l信号点数量明显减少。这提示了神经元中Ash1l功能缺失可能导致自闭症谱系障碍 (Autism Spectrum Disorder, ASD）样形为。

 

根据作出结杲，小说作品创设Ash1l^Emx1-cKO小鼠（特异性在前脑，特别是新皮层和海马区敲除Ash1l,图1G-I），并通过行为学范式发现，前脑Ash1l单倍体不足导致小鼠ASD样行为（图1J-L）。
 

图1 Ash1l单倍体不足导致小鼠的ASD样表型

 

 

Ash1l突变小鼠存在辨别能力缺陷

 

接下来，研究人员对Ash1l缺失小鼠的学习行为进行评估，借助条件性恐惧反射范式发现，Ash1l^+/-小鼠和WT小鼠均学会了情境性恐惧条件反射，并表现出类似的恐惧记忆重提水平，然而Ash1l^+/-小鼠在恐惧学习的第三天表现出木僵行为（freezing, 蟑螂的一项暴击反响）下降；此外，在Ash1l^+/-小鼠中未观察到两种不同环境下的木僵行为差异（WT小鼠在context A中症状出较高的木僵做法，在context B（新场景）中症状出较低的木僵做法），提示了Ash1l^+/-小鼠辨别能力受损（图2A,B）。

 

在唱音依赖感的识别范式（图2C-E）和由于唱音的Go-No-go做法范式（图2F-H）中，Ash1l^+/-小鼠同样表现出明显的听觉辨别障碍（听觉脑干反应（ABR）测试Ash1l^+/-小鼠无明显的听力损失）。

 

为了验证前脑神经元中Ash1l缺失是否会导致与Ash1l^+/-小鼠类似的辨别能力障碍现象，作者借助Ash1l^Emx1-cKO小鼠进行相关行为学范式，发现Ash1l^Emx1-cKO小鼠与惧怕记忆法关联的嗅觉识别业务能力显著的遭到破坏（图2J,K）。这种Ash1l突变小鼠的辨别能力异常符合部分ASD患者的临床表现。前脑Ash1l缺失可导致突触和神经环路功能障碍，以及辨别行为障碍。
 

 

图2 Ash1l^+/-小鼠表现出正常的学习能力，但辨别能力受损

 

 

Ash1l以细胞自主效应的方式介导活动依赖的突触修剪过程

 

随后，作者借助高尔基染色发现，1月龄的Ash1l^+/-小鼠皮层神经元和背侧纹状体中棘神经元（MSNs）的树突棘溶解度正相关延长（图3A），为研究探讨各种毛细现象是不是也取决于突触消去阶段（synapse elimination）的减少，研究人员研究了Ash1^+/-小鼠原代皮层神经元的突触密度变化。用表达ChR2光敏蛋白的慢病毒载体（Lenti-CaMKIIa-ChR2）影响养成的运动神经元，混用LED促进（图3B），挖掘WT神经系统元在LED热血后24h树突突触素（SYP）密度显著降低，而Ash1l^+/-组则未观察到这种现象（图3C,D），提示了Ash1l可能介导了活动依赖的突触修剪过程。活体成像结果显示，Ash1l^+/-组培养的神经元中，活性依赖的突触消除过程被削弱。

 

显然，作著还分析了在小鼠新皮层中渗透性依靠的突触去除，跟踪了痛觉皮层（auditory cortex, AUD）到后顶叶皮层（posterior parietal cortex, PTLp）长远距离投映轴突的转变 。科研专业人员将AAV-EF1a-DIO-EYFP注射器在Rbp4-Cre小鼠AUD，特男人标识嗅觉皮层L5周围神经元（图3H）。小鼠接受音调依赖的恐惧条件训练，成像观察轴突变化发现，声调依赖的恐惧条件学习24h后，Ash1l^+/-::Rbp4-Cre小鼠“bouton”（突触总结）的清楚分明如果低于WT小鼠，而“bouton”造成则保证不便（图3H-J）。

 

为探究这种“突触修剪”过程的缺失是否由Ash1l缺失神经元的细胞自主效应导致的，研究人员将AAV-hSyn-Cre和AAV-EF1a-DIO-EYFP注射于Ash1l^fl/fl小鼠右下AUD区（图3K），对小鼠进行音调依赖的恐惧条件行为学范式训练，在学习之后借助体内成像技术追踪突触的变化，发现Ash1l缺失的神经元中学习依赖的突触的增加数量没有发生改变，而学习诱发的突触的减少数量显著低于正常小鼠（图3K-M）。这些数据提示了Ash1l以细胞自主效应的方式介导皮层神经元的活动依赖的突触修剪过程。
 

 

图3 Ash1l以细胞自主效应的方式介导活动依赖的突触修剪过程

 

 

Ash1l调控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表达

 

接完成来，我研究探讨了其氧分子体制，按照对转录多组分析及染色体精神力论（GO）分析发现，Eph受体EphA7在听觉皮层和背侧纹状体中的表达均显著下调（图4A-C），基于此，研究人员进一步将EphA7作为参与Ash1l介导的突触修剪过程的重要基因之一进行了研究。

 

Eph受体及其配体 Ephrin 统称为Eph家族蛋白，是蛋白酪氨酸激酶家族中的最大成员。Eph/ephrin蛋白作为细胞表面分子，参与调节突触的形成及神经元的可塑性，EphA7是编码Eph受体中14个受体蛋白基因之一，在皮质发育和突触功能中发挥重要作用。

 

随后，研究人员借助音调依赖的恐惧条件行为学范式，在体内/体外均发现Ash1l^+/-小鼠听觉皮层活动依赖的神经元中EphA7表达远低于WT小鼠的（图4D-I），提示了在Ash1l^+/-小鼠中EphA7活动诱导表达受损。
 

 

图4 Ash1l调控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表达

 

 

Ash1l通过拮抗EZH2-H3K27me3来调控EphA7的表达

 

进一步，作者探究Ash1l是如何参与调控EphA7活动诱导表达，通过染色质免疫沉淀技术（ChIP）发现，Ash1l的直接靶点H3K36me2在WT和Ash1l^+/-小鼠AUD EphA7基因位点附近没有明显差异，然而H3K27me3信号（组淀粉酶甲基转出酶复合型体PRC2催化反应的遏制性记号物）在Ash1l^+/-小鼠EphA7基因位点显著增加（图5A,B）。同时，Ash1l^+/-小鼠中H3K27ac（另一款 较为活跃的的明显增强标签。H3K27ac与H3K27me3独享另一款 位置上，留存拮抗效果。）表达出来持续不断变低，用NaB（组蛋白酶去乙酰化酶仰剂型）预处理培养的神经元发现，刺激Ash1l^+/-神经元后H3K27ac升高，EphA7表达恢复（图5C,D）。同样地，行为学结果显示，Ash1l^+/-小鼠中H3K27me3、EZH2（PRC2组合体的同一个核心的崔化酶）表达出标准偏态延长（图5E-G）。按照UNC1999（EZH1/2缓和剂）对培养的神经元进行预处理，发现Ash1l^+/-激活的神经元中EphA7表达受到抑制的现象得到改善（图5I）。上述结果提示了，Ash1l在活性依赖的PRC2介导的转录抑制累积中发挥拮抗作用，从而允许EphA7在激活的神经元中表达。

 

图5 Ash1l通过拮抗EZH2-H3K27me3沉默来调控EphA7的表达

 

 

EphA7高表达可改善Ash1l^+/-小鼠突触修剪过程缺陷和行为异常

 

基于上述结果，研究人员研究了提高EphA7受体活性是否能改善Ash1l突变小鼠的突触修剪过程缺陷和行为异常。Ephrin-A5是EphA7的高亲和力配体，参与下游信号[3,4]。小说作者在教育培养的神经末梢元和小鼠听觉效果皮层中选用Ephrin-A5多聚体的Fc融成蛋白质（Ephrin-A5 Fc）直接刺激EphA7活性[5,6]，发现改善了Ash1l突变小鼠的突触修剪过程和行为异常（图6）。
 

 

图6 Ephrin-A5激活EphA7高表达Ash1l^+/-小鼠突触树枝的修剪的时候缺陷报告和情况不正常

 

 

 

结论

本文借助转基因模型鼠、多种行为学范式、光遗传学技术、活体成像转录组分析及基因本体论分析等多种技术手段，研究发现前脑神经元Ash1l单倍体不足可导致小鼠产生沟通困难、重复刻板行为、社交障碍等类似自闭症样表型，并机制上破坏活动依赖的突触修剪过程，这是以细胞自主效应方式介导的。进一步研究发现，Ash1l可通过介导EZH2-H3K27me3去抑制作用提高EphA7的活性依赖表达，进而影响突触消除过程，并改善Ash1l^+/-小鼠辨别能力障碍及行为障碍。该研究有助于深入了解ASD相关发病机制，为其干预治疗提供了新的思路。

 

 

 

 

原作者介绍书及私募基金数据

 

 

正在上科大管吉松教授课题组进行合作研究的2017级博士研究生闫宇泽(复旦师范大学)和上科大生命学院的田苗苗博士为本文的共同第一作者。上科大生命学院研究生 2016级陈琪楠、2017级郭修贤、2018级李萌、2019级周罡也对本研究做出了重要贡献。管吉松教授、青岛大学附属医院刘世国教授和清华大学熊巍教授为本文的共同通讯作者，研究得到中科院遗传发育所吴青峰研究组、上海理工大学谢红研究组的大力支持。研究也得到了上科大戚炜教授、范高峰教授和上海交通大学医学院徐楠杰教授大量的有益帮助。

 

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原稿微信链接:

//www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(21)01090-4

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借鉴论文

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