供稿人：舒易来专业团体
2022年2月23日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来主任、李华伟教授与中国农业科学院（西安）农业基因组研究所左二伟研究员等团队合作在Cell Research期刊在线发表题为“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究论文。该研究以腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）作为高效的基因治疗递送载体，转染听觉内毛细胞，用一种优化的HMEJ（同源臂介导的末端接合）的基因敲入方法精准修复Klhl18lowf耳聋模型的点突变，实现在体Klhl18lowf基因有效编辑，恢复感受声音的内毛细胞静纤毛形态，并纠正耳聋小鼠模型的听觉功能长达治疗后6个月。这是首批来源于CRISPR/Cas9-HMEJ技术水平疗法隐性遗传的的极致诱惑音感觉神经性聋好的探究，为遗传的的性耳聋的精准定位疗法及及临床药学流量转化具备了强有力的的物理学证人。
据地球卫生学组织化（WHO）中国官网报到，超过了了环球人口总数的5%，即4.615亿人患过致残性倾听思维障碍，另外3400万是婴儿。哪怕研究探讨发觉超过了了120个染色体或非全方位的征型或全方位的征型耳聋相应（//hereditary hearing loss.org/），但诊疗上在隐性基因诱惑美女音脑神经性聋的缓解不但穿戴扩音器和移植人力耳蜗等，目前还没有一切可以有效的药物剂量缓解技术手段。在非宗合征型隐性基因性耳聋中，常染料体隐性隐性基因性耳聋占80% (Korver et al., 2017)。
谈谈隐性隔代遗传型耳聋，适宜的疗法步骤是对DNA变异位点对其进行招商精准地休复，从根本上长时间地恢复原状英语听力。CRISPR/Cas9DNA整理程序是近几年以来来快速发展的当下DNA整理APP，已在患病的疗法中注意表现出了很大的广泛应用竞争力。该程序注意由sgRNA和Cas9两个排序成，这多种方法达成混合体， sgRNA与靶位点倒置互替实现目标准确定位后，而且辨认PAM回文序列，Cas9核酸酶切割器DNA，造成 DNA进行断开。細胞内注意有多种DNA问题休复考核机制，非同源终端链接（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源资产重组解决（Homologous recombination，HR）。当有外源性DNA样例有着时，利用率HR是可以完成编码序列的随机精确度变幻或是定时复制到，但其质量不够，更是要格外重视在非裂变内部中，HR的质量更低，这诸多上限了HR在基因组治疗方法科技领域的应运。
科学研发人员在仍然的科学研发韵达过在同源文档模板下方引进sgRNA的靶位点，联合开发了了种以同源臂介导的尾端紧密连接（Homology-Mediated End Joining，HMEJ）为基础性的什么是基因敲入营销策略 (Yao et al., 2017)，在内、体内均建立了更高效而精确性的资源优化配置（图1）。HMEJ介导的DNA敲入步骤为是指DNA排版生物沙盘模型的实现和隐性DNA性疫情的靶点靶点DNA方法等作为了广泛的发展前途。迄今为止，暂无特征提取CRISPR/Cas9介导的HR手段开始耳聋DNA方法的肚子里科研。
图1 制定HMEJ同源重新组合手术方法策划方案。a 重要性需求的sgRNA，制定HMEJ同源臂。b 鉴于AAV做体中递送各种质粒的双AAV手术方法制度，里面的AAV递送采用表现出来Cas9的各种质粒，其余的递送表现出来sgRNA及及随带同源臂的各种质粒。
Klhl18lowf小鼠模型
Klhl18lowf小鼠模型是指Klhl18 p.V55F发生错义点突变（Chr9:110455454 C>A），其纯合子小鼠表现为第4周开始出现以低频为主的渐进性听力下降，随着年龄增长，听力下降逐渐累及其它频率，最后发展为全频型严重耳聋，而杂合子小鼠听力正常，表现为隐性遗传。Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠模型在形态学方面表现为耳蜗内毛细胞纤毛的形态异常 (Ingham et al., 2021)。
CRISPR/Cas9-HMEJ管理体制
该研究首先针对基因Klhl18lowf突变位点设计、筛选和构建了HMEJ治疗体系。在新生小鼠皮肤成纤维细胞中进行体外sgRNA筛选，发现sgRNA2的效率较高。将表达Cas9的质粒与携带HMEJ同源模板和表达sgRNA2的质粒共同转染至带有Klhl18lowf突变的成纤维细胞中，发现突变位点明显得到了的纠正，且sgRNA2不产生明显的脱靶编辑。
鉴于CRISPR/Cas9-HMEJ装修标准体中证实
体外实验证实设计的HMEJ系统可以精确纠正Klhl18lowf点突变后，该研究进一步在体内探索该系统的疗效。用双AAV包装CRISPR/Cas9-HMEJ基因修复体系，即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor，将其在Klhl18lowf新生鼠出生后1天（P1）显微针剂至小鼠的内耳。在小鼠P14和10周龄时，里面编效果查重成果反映，双AAV调理软件在体实现目标改正了Klhl18遗传基因C>A点突然变化率率，由于编用时的延缓，10周龄的修复能力效果提升了约3倍，而在未针剂耳中，没了关注到比较明显的碱基进到这一领域、不足或突然变化率率碱基的改正。经过打印机扫描电镜系统，与原生态型小鼠好于，发觉8周龄的未调理纯合突然变化率率小鼠的内孔状管胞最快一行静纤毛情况为更长、更细且上面成尖细的碗形，而调理后的小鼠有部件内孔状管胞的静纤毛还原很没问题情况的型态特征，情况为最快一行静纤毛大部件呈柱形且更短。在调理后小鼠耳蜗的顶圈和中圈，年均约16%的内孔状管胞极具很没问题情况或取决于很没问题情况的纤毛束型态特征。听性脑干化学反应（auditory brainstem response, ABR）测试结果显示注射AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治疗体系后8周，注射耳的ABR阈值在8、16、24和32 kHz均比未注射耳明显下降，且治疗效果持续至小鼠24周龄（实验所关察期）。电生理性检验然而彰显，在较时间间隔（200 ms）的去极化脉冲刺激条件下，未注射耳的内毛细胞膜电容与野生型相比明显下降，而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治疗体系能将注射耳内毛细胞膜电容恢复至野生型水平，即治疗体系修复了内毛细胞持续囊泡释放功能。
综上所述，基于CRISPR/Cas9-HMEJ策略可对体内内耳毛细胞中的基因突变位点进行精准的纠正，恢复了耳蜗部分内毛细胞静纤毛形态、修复了内毛细胞持续囊泡释放功能并持久改善了Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠的听觉功能，为最终在人类隐性遗传性耳聋及其它器官系统隐性遗传性疾病中实现安全、持久的基因治疗提供了科学依据和参考。
复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来研究员、李华伟教授和中国农业科学院（长沙）农业基因组研究所左二伟研究员为共同通讯作者，顾晰博士后、胡新德博士后（中国国学科有效院周围神经学科有效论述所）和王大奇教授后为同时第二写作者。
