10x 3’单体细胞

回收利用10x Genomics Chromium微流控系統，实行借助队列标识纸其别不一样组织上皮组织生殖细胞系和转录本。微流控系統入口工作区截面积不大一下借助某个组织上皮组织生殖细胞系。最先在入口工作区添加如具有标识纸的疑胶的作用的作用微珠，单独的组织上皮组织生殖细胞系和单独的具有标识纸的疑胶的作用的作用微珠组合，其实两者被加如的油快递包裹到某个液滴中，造成油包水体制。疑胶的作用的作用微珠上具有更多含有疑胶的作用的作用微珠特情人Barcode队列、大碳原子式特情人UMI队列和polyT队列的引物队列，将组织上皮组织生殖细胞系裂解后mRNA大碳原子式被引物队列中的polyT驯服，增加后造成携具有Barcode和UMI队列的cDNA，就行了实行将不一样组织上皮组织生殖细胞系源头的不一样mRNA大碳原子式加在标识纸。

Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，每个微珠表面携带有几十万个Oligo序列（如下图）。Oligo dT序列由4个部分组成：read1用于上机测序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带不同的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序列进行绝对定量，避免扩增产生偏好；第四段是30bp的ployT，用于捕获有ployA尾的转录本。

对化学合成好的单组织悬液先进的行质监，质监优秀率后与Gel Beads和油分离申请加入到Chromium Chip G的各不相同车道，经过微流体力学“T字”交叉点系统性转变成GEM。随后组织裂解，Gel Beads自动化充分均匀溶解减少海量引物编码序列，与配有PolyA的mRNA来逆袭录，生成二维码配有10x Barcode和UMI问题的cDNA第一次链。

样本起始量与送样建议

组织类型	新鲜组织、新鲜悬液或速冻组织
肿瘤细胞宽度	＜40 μm
体细胞活性酶类	>85%（一定要消除细胞系团/勾玉/钙镁离子等）
细胞膜渗透压	700~1200 cells/μL
生殖细胞总数	＞2万

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生物信息学分析内容

代表性文章

【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.

案例展示

Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性
论文标题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
发表杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，手术切除肿瘤样本P1
技术手段：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选

研究背景

肝细胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。由各种细胞表面标志物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，这在定义靶向疗法时构成了挑战。研究人员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和功能分析用以评估CSC的异质性程度。结果表明，CSC在单细胞水平上的表型、功能和转录均存在异质性性，不同的CSC亚群具有不同的分子特征。而且有趣的是，不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关，并且彼此相互独立，表明CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。

短文导致

大量数据表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面标志物可以定义CSC，研究人员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7不同细胞亚群，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。免疫荧光染色表明，在两种细胞培养形态下（单层培养、球体培养）,两个HCC细胞系均表现出明显的细胞异质性。

HuH1和HuH7体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜系（原来体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜数各是为是1343、1134）平常陪养和异星工厂陪养（使得体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜油性）2周后，探析人行政规章两类外面标准物（CD24、CD133、EpCAM）分选体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜，HuH1和HuH7中标公示准物抗体弱阳的CSCs比列各是为为15-20%、8-12%，而标准物假弱阳CSCs比列只能有0-5%（下面的图A-B），陪养后其他体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜亚群的自我认知版本更新实力异同特别大（下面的图C-D）；分选后的体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜经过了3个月陪养后，和未分的得体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜相信，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜就能变大变成混后CSCs，而存留下的Triple-体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜就能变大成混后CSCs，将是主要是因为有些体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜非是切实的图标假弱阳体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜，甚至图标假弱阳体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜经厉了转化成换成图标抗体弱阳体生殖神经组织生殖肿瘤体上皮内部系膜（下面的图E）。

阐述相关人员选择SMART-Seq方式阐述HuH1和HuH7阳性反应标出人体人体组织受损細胞核系还有分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-人体人体组织受损細胞核系）人体人体组织受损細胞核系展示谱（另外某个人体人体组织受损細胞核系测序、10人体人体组织受损細胞核系分层测序、100人体人体组织受损細胞核系分层测序）信心，并与动态的数据库表中人胚胎干人体人体组织受损細胞核系（hESC）、鼠内皮人体人体组织受损細胞核系（mEC）和鼠造血干人体人体组织受损細胞核系（mHSC）展示谱动态的数据库第一次做更加，察觉到有的一定的相互影响人体人体组织受损細胞核系类群还具有有的一定的相互影响的dna展示摸式，且有的一定的相互影响多种类型人体人体组织受损細胞核系中每隔人体人体组织受损細胞核系的dna展示摸式均的长期存在的一定的相互影响，HuH7人体人体组织受损細胞核系间的一定的相互影响超出HuH1；当人体人体组织受损細胞核系分层（10人体人体组织受损細胞核系分层、100人体人体组织受损細胞核系分层）后种的一定的相互影响地步很深有效降低（如图所示A）。而当另外聚类分析法HuH7人体人体组织受损細胞核系时，察觉到有的一定的相互影响标出人体人体组织受损細胞核系这样需要判别（如图所示B）。之上动态的数据库均阐明单人体人体组织受损細胞核系水准上转录组的长期存在异质性。

理论研究考生更了HuH7弱阳标上神经元（Triple+）和阴标上神经元（Triple-）遗传表观遗传传达差距，亲子鉴定到的286个Triple+有关系遗传表观遗传还可以分析原于LCI列队的240例淋巴肉瘤模板、原于TCGA的250例淋巴肉瘤模板的布局孤岛生存率，但在非淋巴肉瘤模板中有意无意义。

多种标出CSC生殖癌细胞膜受众团队DNA表答相对比较浅析，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+特证描述DNA大多不相交（所示A），IPA环路浅析也说明多种生殖癌细胞膜受众团队的环路就说相交（所示C-F），同时多种生殖癌细胞膜受众团队特证描述DNA还可以用以活期分析，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有优势与劣势（所示B）。

为总体熟悉肿瘤神经人体肿瘤血受损内部群多元性，深入定性分析人数按照10X 单肿瘤神经人体肿瘤血受损内部测序的方式，对384几个HuH1、HuH7、P1肿瘤神经人体肿瘤血受损内部实现了定性分析， HuH1会构成俩亚群，HuH7构成4个肿瘤神经人体肿瘤血受损内部亚群，P1构成3个肿瘤神经人体肿瘤血受损内部亚群，肿瘤神经人体肿瘤血受损内部聚类分析法数据与与SMART-seq数据近似于（右图A）。CSC圆形标志物，比如说EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （右图B）还有HCC特异染色体，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（右图C）在不一样肿瘤神经人体肿瘤血受损内部亚群中传达有着异质性。P1的3个肿瘤神经人体肿瘤血受损内部亚群中传达了深山中指数公式 (KLF4、POU5F1、MYC)，干肿瘤神经人体肿瘤血受损内部marker (NANOG)，白肿瘤神经人体肿瘤血受损内部marker(PTPRC), T肿瘤神经人体肿瘤血受损内部 markers (CD3E, CD8A) 和B肿瘤神经人体肿瘤血受损内部marker (CD79A) ，但其传达也有着异质性，各举1、个和2个P1亚群为HCC浸润性白肿瘤神经人体肿瘤血受损内部（分别为传达T肿瘤神经人体肿瘤血受损内部marker和B肿瘤神经人体肿瘤血受损内部marker），三是个P1亚群聊要以HCC肿瘤神经人体肿瘤血受损内部（右图D）。

参考文献

Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778

结果展示

1. 单癌细胞亚群细分

针对PCA结果中选取前10个主成分，采用graph-based聚类方法对细胞进行分类。使用相同的数据进行t-SNE分析，然后将聚类结果在t-SNE映射中展示。

2. Marker染色体具体分析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图

3. 地域差异DNAKEGG含有性了解

Pathway通路图展示与说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差异表达转录本，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差异表达转录本，橘黄色代表注释到某个ko节点不仅有上调又有下调的显著差异表达转录本。方框内的4位数字表示各种酶的EC编号；空心圆圈表示小分子化合物；实心箭头表示生化反应的方向；虚线箭头连接其他的相关代谢途径。下图仅为报告中的展示图片

常见问题（FAQ）

1、单细胞转录组测序需要做重复吗？

单细胞测序的目的在于鉴定细胞群体中的不同亚群、得到新的重要分子标志物和鉴定稀有细胞亚群等，因此更多的是关注细胞和细胞之间的差别。从目前已有的文献看，对重复数没有强制要求。但从近期的发文趋势来看，建议每组设置样本数3~5 个，临床样本根据实际情况建议每组 5 例以上。

2、组织样本如何制备单细胞悬液？

单细胞转录组测序目前没有一个统一的样本制备方法，针对于不同的组织样本，有不同类型的样本单细胞制备方法。此外，可以具体根据老师提供的具体样本类型，查阅相关的文献，探讨适合于老师样本的单细胞悬液制备方法。

3、单细胞转录组每个细胞能捕获到多少个基因？

根据不同的细胞类型，捕获到的基因数会有区别，有些细胞类型高的会在3000左右，而有些大概在1000左右。基因检出数与样本状态有关，不同类型的样本，基因检出数可能存在数倍的差异。

10x 3’单体细胞

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